环状RNA在糖尿病及其慢性并发症中的机制研究

张懿恋，张诗雨，胡 吉，张弘弘

苏州大学附属第二医院内分泌科，江苏苏州 215004

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种由遗传、生活方式、环境改变以及免疫调节等因素引起的以高血糖为主要特征的代谢性疾病[1]。随着人口增长和生活方式的急剧变化，预计在未来几十年糖尿病将成为人类主要死亡原因之一。据国际糖尿病联合会2017年报道，约4.249亿年龄在20～79岁之间的人患有糖尿病，预计这一数字到2045年将增长63%[2]。糖尿病的并发症严重影响患者生活质量及预期寿命，主要包括微血管病变，如糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病神经病变和大血管病变，如心脑血管疾病和外周动脉疾病等。

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)包括长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)和环状RNA(circular RNA，circRNA)。circRNA是一类特殊的非编码RNA，其分子以共价键形成封闭环状结构，不易被核酸外切酶降解，表达比线性RNA更加稳定。circRNA在哺乳动物大量表达并稳定存在；功能上，circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到一种类似于“miRNA海绵”的作用，解除miRNA对其靶基因的抑制。有部分circRNA能够翻译生成特定肽段并发挥一定生理功能。除此之外，circRNA还可与蛋白质相互作用，影响功能蛋白质的亚细胞定位，影响RNA结合蛋白下游靶基因的表达与功能等。最近的研究表明，circRNA在糖尿病及其慢性并发症的发生发展中起着重要作用[3]。具体来说，糖尿病并发症的出现是由一个复杂的基因调控网络精细控制的，其中circRNA发挥关键作用。

circRNA的简要概述

circRNA是具有组织和细胞特异性表达模式的新型ncRNA成员[4]。circRNA的生物发生可能涉及三种模式：第一，内含子配对驱动的环化；第二，外显子跳跃和内含子套索形成；第三，RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)介导。circRNA的生物发生可能受到RBP、转录因子以及顺式作用元件和反式作用剪接因子的组合的调控[5]。由于核糖核酸测序和生物信息学工具的快速发展，根据在基因组中的来源及其构成序列的不同，circRNA可以分为3类：外显子衍生的circRNA，内含子衍生的circRNA和外显子内含子的circRNA(EIciRNA)。大多数circRNA都是外显子衍生的circRNA[6]。

功能上，circRNA主要作为竞争性内源性RNA或miRNA海绵发挥作用，从而影响miRNA靶基因的表达水平，这被认为是circRNA领域最常见的调控机制[7]。除了作为miRNA海绵发挥作用，circRNA还能翻译某些特定蛋白质或者与蛋白质相互作用。一些circRNA包含负责驱动翻译的内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site，IRES)，例如研究发现circFBXW7在正常人脑中大量表达，并且可以编码新型21kD蛋白。这种新型蛋白的上调可以抑制神经胶质瘤细胞的增殖和细胞周期加速[8]。另外，circPABPN1与其同源mRNA对RNA结合蛋白HuR的竞争可以影响相关蛋白的表达[9]。

circRNA与糖尿病

糖尿病患者由于维持血糖稳态的血浆胰岛素水平不足而出现高血糖。因此，影响胰腺β细胞质量、胰岛素合成和分泌以及胰岛素敏感性的各种分子在糖尿病发生发展中发挥着重要作用[10-11]。与糖尿病有关的最著名的内源性circRNA是CDR1as(也称为ciRS-7)。研究显示，CDR1as的过表达导致胰岛素基因转录和分泌增加，改善胰岛β细胞功能[12]。CDR1as通过充当miR-7海绵并增强Myrip和Pax6基因表达来促进糖尿病中胰岛β细胞的增殖和胰岛素分泌[12]。还有研究发现在糖尿病小鼠的胰岛中，circHIPK3和CDR1as的表达显著降低[13]。同样，在高血糖治疗的人脐静脉内皮细胞和糖尿病患者的主动脉内皮细胞中，circHIPK3的表达均显著降低[14]。此外，研究表明circHIPK3通过结合miR-192-5p、上调FOXO1诱导高血糖和胰岛素抵抗[15]。提示CDR1as和circHIPK3可能是糖尿病的潜在治疗靶标。

糖尿病主要分为4种类型，包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他类型糖尿病，而circRNA在不同类型的糖尿病中表达也存在差异，以下主要介绍特异性表达于1型和2型糖尿病中的circRNA。

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一种自身免疫性疾病，占所有糖尿病的5%～10%，主要表现为胰腺β细胞减少、胰岛素缺乏和持续高血糖。巨噬细胞在T1DM的发病过程中发挥重要作用。circPPM1F主要表达于单核细胞中，并在T1DM患者中显著上调。功能上，circPPM1F通过增强NF-κB信号通路促进脂多糖(LPS)诱导的M1巨噬细胞激活。circPPM1F竞争性与Hu蛋白结合阻碍蛋白质磷酸酶的翻译，从而减轻蛋白磷酸酶Mg2+或Mn2+依赖的1因子(PPM1F)对NF-κB通路的抑制作用，进而加重糖尿病小鼠胰腺损伤[16]。另有研究显示，T1DM儿童外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)hsa_circ_0060450存在差异表达。进一步分析显示hsa_circ_0060450可以作为miR-199a-5p的海绵，释放它的目标基因SH2-SHP2(含蛋白酪氨酸磷酸酶2的SH2)，并进一步抑制Ⅰ型干扰素引发的JAK-STAT信号通路来抑制巨噬细胞介导的炎症反应[17]。另外，T1DM中hsa_circ_0072697可能参与了和糖尿病相关的50个circRNA-miRNA-mRNA信号通路，例如circ_0072697-miR-15a-UBASH3A网络[18]。

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是最常见的糖尿病类型，占所有糖尿病的90%以上，主要发病机制包括胰岛β细胞功能衰竭和胰岛素抵抗。一项研究显示，与健康人相比，T2DM患者外周血中，78个circRNA表达上调，411个circRNA表达下调。其中hsa_circ_0054633对糖尿病前期和T2DM具有一定的预测作用[19]。另一项研究显示，T2DM患者血清中circ_CCNB1显著升高，而circ_0009024显著降低。has_circ_CCNB1与葡萄糖、糖基化血红蛋白、白介素-6、肿瘤坏死因子负相关[20]。此外，在人类胰岛中最丰富的5种circRNA中，有4种(circCIRBP、circZKSCAN、circRPH3AL和circCAMSAP1)与糖尿病状态显著相关。在分离的人胰岛中，circCIRBP与胰岛素分泌指数相关，而在0.5 mmol/L棕榈酸盐处理后的EndoC-βH1细胞中，circCIRBP表达增加，circRPH3AL表达减少[21]。有研究发现circRNA_008565可能是潜在的细胞自噬调节因子，它通过抑制miR-504来调节MAPK8(JNK)功能和大鼠胰岛细胞自噬[22]。此外，在糖尿病模型中circ-Tulp4水平明显降低，circ-Tulp4与miR-7222-3p相互作用，抑制胆固醇酯化相关基因甾醇O-酰基转移酶1(sterol O-acyltransferase-1，SOAT1)的表达。SOAT1的积累激活了cyclin D1的表达，从而促进了细胞周期的进展。提示circ-Tulp4通过miR-7222-3p/soat1/cyclin D1信号通路调控细胞增殖，它可能是治疗T2DM的一种潜在手段[23]。

circRNA与糖尿病并发症

糖尿病性视网膜病变糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy，DR)是导致失明的重要原因之一[24]。该疾病影响大约1/3的糖尿病患者[25]，80%病程20年以上糖尿病患者合并DR[26]。研究显示，circ_0005015在DR患者血浆、玻璃体和纤维血管膜中显著上调，应用siRNA敲减circ_0005015的表达，可抑制视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和血管形成，延缓DR进展[27]。另一项研究显示，增殖性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的hsa_circ_0001953与正常组及非PDR组相比升高，且与糖尿病持续时间和糖化血红蛋白(HbA1c)呈正相关，进一步分析发现该circRNA可与数十种miRNA相互作用，并且通过调控相应的靶向mRNA参与PDR的发病[28]。

在模型动物中的研究显示，糖尿病小鼠视网膜血管circZNF532表达上调。沉默该circRNA降低了周细胞的活力、增殖和分化，抑制了周细胞向内皮细胞的募集。该研究还发现，circZNF532作为miR-29a-3p海绵，促进NG2、LOXL2和CDK2的表达，从而调控周细胞生物学功能；敲除circZNF532或过表达miR-29a-3p加重了链脲佐菌素诱导的视网膜周细胞变性和血管功能障碍[29]。另一项研究显示，circDNMT3B通过调节miR-20b-5p和BAMBI导致糖尿病视网膜的血管功能障碍。糖尿病状态下，miR-20b-5p表达上调，通过靶向调控BAMBI表达，促进人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cell，HRMEC)的增殖、迁移和管状形成，过表达circDNMT3B可减少糖尿病大鼠视网膜周细胞毛细血管数量，减轻视觉损伤[30]。

离体细胞中的研究显示，circRNA_0084043在高糖培养的ARPE-19细胞中升高，该circRNA的缺失显著增加了细胞存活并抑制了高糖触发的细胞凋亡，而下调该circRNA显著降低了氧化应激，并可以有效抑制高糖刺激的炎症反应，抑制ARPE-19细胞中的炎性细胞因子、白细胞介素-6和Cox-2。此外，该circRNA还可通过海绵吸附作用调控miR-140-3p和转化生长因子(transforming growth factor，TGF)的表达，抑制高糖诱导的细胞损伤[31]。还有研究发现，Hsa_circ_0041795在高糖处理的ARPE-19细胞中明显上调，该circRNA通过miR-646/VEGFC调节ARPE-19细胞的存活，促进细胞凋亡[32]。在高糖诱导的hRMEC中，circCOL1A2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、MMP-2、MMP-9水平升高，而miR-29b水平降低。circCOL1A2通过海绵吸附作用调控miR-29b表达，并促进VEGF表达。沉默该circRNA可增强miR-29b的表达，抑制VEGF表达，进而抑制高糖诱导的HRMEC的增殖、迁移、血管生成和血管通透性，提示靶向circCOL1A2可能是DR的潜在治疗手段[33]。此外，在DR患者和高糖诱导的HRMEC中，miR-1243、circ_0002570和血管素均有异常表达，circ_0002570可以通过靶向miR-1243上调血管素，介导高糖诱导的HRMEC功能障碍[34]。

糖尿病肾病糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是另一种继发于糖尿病的渐进性微血管并发症，是糖尿病患者慢性肾衰竭的最常见原因[35]。研究表明，circRNA_15698在db/db小鼠和高葡萄糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell，MC)中表达均上调，该circRNA可以充当miR-185的海绵，下调 miR-185，阻断其对TGF-β1的抑制作用，从而加重细胞外基质的沉积[36]。circ-AKT3在DN小鼠及高浓度葡萄糖培养的小鼠系膜SV40-MeS13细胞中水平明显降低，该circRNA通过调节miR-296-3p/E-cadherin信号，抑制了细胞外基质蛋白的合成，这也可能为DN的临床诊断和治疗提供生物标志物及潜在靶点[37]。circ_0037128在小鼠DN模型和高糖处理的MC中表达显著升高，体外抑制该circRNA可改善细胞增殖和纤维化，进一步研究发现该circRNA是通过miR-17-3p/AKT3通路促进DN的发展[38]。circ_0123996在DN患者、DN小鼠模型高糖培养的MMC中均明显增高，该circRNA通过海绵作用吸附miR-149-5p上调Bach1表达，抑制细胞增殖和纤维化[39]。还有研究显示，糖尿病状态下，circ_0000064/miR-143[40]、circ_008045/miR-24-3p[41]、circ_0080425/miR-24-3p[41]通路均可促进MC的增殖和纤维化。近期的研究表明，circLRP6是一种新发现的非编码RNA，在高糖处理的MC中显著表达，可以充当miRNA-205的海绵，抑制HMGB1并激活TLR4/NF-κB途径，调节系膜细胞增殖、氧化应激、ECM积累和炎症[42]。另一个新发现的circRNA circ_0000491通过靶向TGFβ受体Ⅰ，加重DN小鼠肾小球系膜细胞的细胞外基质沉积，该circRNA在DN小鼠和高糖诱导的MeS13细胞中均显著升高，抑制该circRNA显著抑制波形蛋白、纤连蛋白和平滑肌肌动蛋白以及Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原的增加，同时逆转了高糖诱导的MeS13细胞中e-cadherin的减少，该研究提示circrna_0000491可能是治疗DN的潜在靶点[43]。

以上研究均提示circRNA可通过一定的机制促进系膜细胞增殖及细胞外基质沉积，那么，糖尿病状态下，circRNA对其他肾脏实质性细胞的影响如何？研究显示，circACTR2在高糖诱导的肾小管上皮细胞中表达上调，抑制该circRNA可显著降低细胞焦亡、白细胞介素-1释放、Ⅳ型胶原和纤连蛋白的生成，表明该circRNA可有效调节近端肾小管细胞炎症和死亡，该研究探讨了circRNA在小管细胞焦亡中的作用，为DN的发病机制和治疗提供了新的视角[44]。circ_WBSCR17在DN小鼠模型和高糖诱导的HK-2细胞中高表达，该circRNA通过miR-185-5p/SOX6调控轴，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡、炎症反应和纤维化[45]。hsa_circ_0003928和Anxa2 mRNA在DN患者及高糖诱导的小管上皮细胞HK-2细胞中的水平均明显升高，而miR-151-3p水平降低，敲除该circRNA可增加Bcl-2表达，降低Bax和cleaved caspase-3表达，改善细胞活力、减轻炎症和凋亡[46]。还有研究显示，circ_0000285在DN小鼠模型和高糖孵育的足细胞中显著升高，而miR-654-3p明显下调，进一步研究发现该circRNA通过海绵化作用结合miR-654-3p、激活MAPK6促进足细胞损伤[47]。

糖尿病神经病变糖尿病神经病变(diabetic neuropathy，DN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一，影响了50%以上的糖尿病患者[48]。它主要累及周围神经、自主神经和脑神经等，大脑和脊髓也会受到影响[49-50]。糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)常表现为肢体远端对称性麻木。DPN具有广泛的病理改变，包括炎症浸润、脱髓鞘和轴突丢失[51]。研究显示，长链非编码RNA通过靶向miR-146a-5p，调控XR_589933、XR_351905、XR_357013、XR_589615、XR_595664表达，促进神经炎症反应，提示 lncRNA可能通过吸收miR-146a-5p参与DPN的发病过程[52]。

近期的研究显示，糖尿病小鼠的坐骨神经和背根神经节的超微结构发生了显著变化。在WT和DM小鼠之间的DRG中鉴定出311 004种circRNA和15种差异表达的circRNA，以及35368个mRNA和133种差异表达的mRNA。共表达分析显示，有11个circRNA和14个mRNA具有显著相关性[53]。其中circRNA.4614的表达明显上调，与circRNA.4614显著相关的mRNA是Olfr397和Slc30a10[53]。其中，Slc30a10是一种锰外排转运蛋白，可以增加血液和大脑中的锰含量，可引起严重的神经毒性[54]。由此可见，circRNA亦可能参与了DPN的发生发展。

糖尿病性心肌病据统计，65%的DM患者的死亡原因为心血管系统疾病。糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病心脏并发症之一，心脏纤维化是DCM的重要病理基础。有研究发现，糖尿病患者心肌中circRNA_000203表达上调，并且与心脏成纤维细胞中α-SMA、Col1a2和Col3a1的表达增加有关。该circRNA主要通过调控miR-26b-5p抑制Col1a2和CTGF等下游靶标。还有研究发现，circRNA_010567通过miR-141/TGF-β1途径促进心肌纤维化[55]。另外，hsa_circ_0076631，即与胱天蛋白酶1相关的circRNA(CACR)，在高糖处理的心肌细胞和糖尿病患者的血清中表达增加，并通过靶向调控miR-214-3p/caspase-1途径介导心肌焦化[56]。mmu_circ_0000652/mir-195/Bcl2和mmu_circ_0001058/mir-21/sprouty homolog 1(SPrY1)是典型的ceRNA调控机制的代表。Bcl2是细胞凋亡过程中的关键调控分子，SPrY1与间质纤维化有关，结果提示mmu_circ_0000652和mmu_circ_0001058可能在早期DCM中发挥重要作用[57]。

糖尿病血管病变糖尿病血管病变的病理改变之一是血管内皮细胞功能障碍。研究表明，circRNA失调可能是血管内皮细胞受损的新因素。有报道显示，has_circ_0054633在T2DM患者和健康人外周血中差异表达[58]。hsa_circ_0054633可调节高糖诱导的人血管内皮细胞功能障碍[59]，通过miR-218/血红素加氧酶-1轴对高糖诱导的内皮细胞功能发挥保护作用。另外，高糖处理的人血管平滑肌细胞中，circWDR77(hsa_circ_0013509)明显上调，沉默hsa_circ_0013509有助于血管平滑肌的功能恢复[60]。circBPTF在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞中表达升高，敲减该circRNA，通过miR-384/LIN28B轴，增加细胞活力并抑制细胞凋亡、促炎细胞因子的释放和氧化应激[61]。hsa_circ_0058092在高糖条件下表达降低，过表达该circRNA，可通过miR-217/FOXO3，保护内皮细胞存活、增殖、迁移和血管生成分化[62]。还有研究表明，circVEGFC可通过miR-338-3p/HIF-1/VEGFA轴，促进高糖诱导的内皮细胞凋亡，为糖尿病内皮细胞损伤提供了一种潜在的治疗靶点[63]。

糖尿病足溃疡糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcers，DFU)是糖尿病患者最常见的下肢并发症之一，给家庭和社会带来沉重的社会经济负担。研究发现，脂肪来源的间充质干细胞的自体移植可促进糖尿病患者伤口的愈合。结果显示，通过在高糖条件下促进自噬激活，含有高浓度mmu_circ_0000250的外泌体对内皮祖细胞功能恢复起到很好的促进作用。mmu_circ_0000250的表达通过miR-128-3p吸附促进了SIRT1的表达，从而增加了伤口皮肤的血管生成，并通过自噬激活抑制了细胞凋亡并促进了糖尿病患者的伤口愈合[64]。还有研究显示，hsa_circ_0084443在DFU表皮角质形成细胞中上调，调节角化细胞的迁移和增殖[65]。此外，血清和外泌体hsa_circ_0000907和hsa_circ_0057362可作为DFU早期诊断的生物标志物[66]。

结论与未来展望

综上所述，circRNA的功能具有多样性，影响多种生命过程。在糖尿病及其慢性并发症发生与发展中亦发挥着重要作用，有可能为糖尿病及其慢性并发症的诊断提供新的生物标志物，并为治疗提供新的潜在靶点。很明显，在未来几年，circRNA生物学领域很可能成为包括糖尿病及其并发症在内的许多人类疾病的一个新的研究热点。

然而，目前的研究还存在一些局限性。首先，circRNA的调节回路和降解机制在很大程度上尚不清楚。其次，circRNA可能具有与其他RNA类似的二级结构，这可能对其发挥生物学功能很重要。然而，关于circRNA二级结构的研究尚未得见。第三，circRNA的组织特异性模型及其在液体活检和细胞外囊泡中的稳定性使其成为糖尿病及其并发症的有前途的生物标志物或靶点。目前尚不清楚以circRNA为基础的治疗方法是否会产生副作用或降低药物反应性。第四，circRNA与其他ncRNA如lncRNA、piRNA、tsRNA的相互作用还是一个有待解决的问题。总而言之，这些关于circRNA在糖尿病及其并发症中的意义的问题仍有待于在未来得到解答。