水稻白叶枯病发病过程及抗病育种新思路

徐如梦，李冬月，刘秀丽，严成其，陈剑平，王栩鸣*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321000； 2.浙江省农业科学院 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021； 3.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

水稻是我国主要的粮食作物之一，也是全世界大量人口的主粮。然而，水稻因其固定的生长环境和单一的种植模式容易遭受各种病虫害的侵袭，每年水稻因病害、虫害以及不良的环境因素造成大量的经济损失。水稻白叶枯病作为一个传统病害，曾经在浙江等地沉寂了很长时间，但是最近由于气候、耕作条件等变化，白叶枯病的发生也在逐年加重，造成了巨大的经济损失。水稻白叶枯病是由水稻黄单胞菌水稻致病变种引起的一种细菌性维管束病害，于1884年在日本福冈县被首次发现[1]。目前，防治病害的主要措施还是利用杀菌剂，但长期大量的使用杀菌剂不仅会对生态环境造成污染，还会造成谷物农药残留、稻米的品质以及安全性下降，不当的农药使用还会导致病菌抗药性增强，使病害变得更加严重，削减防治的效果。然而，抗性基因的挖掘和其抗病机理的研究，为水稻抗病资源的高效利用以及病害的防控提供了新的思路。1995年，宋文源等[2]克隆了水稻中的第一个抗白叶枯病基因Xa21。迄今为止，已经在水稻中克隆了16个白叶枯抗病基因，分别是Xa1[3]、Xa2[4]、Xa3/Xa26[5]、Xa4[6]、xa5[7]、Xa7[8]、Xa10[9]、xa13[10]、Xa14[4]、Xa21[2]、Xa23[11]、xa25[12]、Xa27[13]、Xa31(t)[4]、xa41(t)[14]和Xa45(t)[4]。近年来，水稻抗病基因与Xoo无毒基因之间互作的分子机制已经被广泛研究，促使水稻与Xoo之间的互作机制成为研究水稻与病原细菌相互作用的模型。为此，本文对水稻与Xoo之间的互作网络进行综述，剖析水稻抗病基因与Xoo无毒基因之间互作的分子机制，以期为水稻抗病分子育种提供理论支持。

1 Xoo对水稻的侵染过程

水稻白叶枯病主要发生在热带和温带稻区，集中分布在亚洲、澳大利亚北部、拉丁美洲、非洲等地区[15]。水稻白叶枯病最初被认为是一种由酸性土壤环境引起的非侵染性病害[16]。20世纪初，科研工作者从患病的水稻叶片上分离和纯化出了大量的细菌，并通过将这些细菌接种到同一水稻品种的健康叶片上重现了该症状[16]。后来，该病害被确定为细菌性病害，从中分离纯化的病原物被作为一个新的物种命名为Xoo[17-18]。

在接触到水稻叶片后，Xoo可以通过水孔或伤口进入叶片细胞进行半活体营养型生殖[1]。水稻叶片在夜间通常会出现“吐水现象”，这些从水孔中渗漏出的水滴会将叶表面的Xoo悬浮起来，从而使Xoo通过主动或被动的形式进入叶片细胞[19]。在侵入植物后，Xoo主要在水稻叶片的下表皮细胞间隙生长和繁殖，并通过木质部进入和传播到植物的其他部位[20]。几天时间内，Xoo和其产生的胞外多糖便会充满木质部导管，并从水孔渗到叶尖和叶边缘上形成珠状或丝状渗出物[15]。这些渗出物会使水稻的叶尖和叶边缘形成绿色的浸水斑点，随着时间的推移这些斑点会沿着叶脉延伸逐渐使叶片黄化直至坏死形成不透明的灰白色病斑[16]。

2 水稻抵御Xoo侵染的免疫防御反应

在与病原微生物协同进化过程中，植物发展出了多种策略来保护自己免受疾病侵害。其中，拟南芥与病原物互作系统作为一种模型系统研究得较为透彻[21-22]。与拟南芥一样，水稻也进化出了两层免疫系统：第一层是由模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)触发的免疫反应(pattern-triggered immunity，PTI)，主要是通过植物细胞膜上的模式识别受体来感知由病原物产生的病原物相关的模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，从而触发相对较弱的免疫反应来抑制或阻止病原菌的侵染；第二层是由病原菌无毒基因编码的效应蛋白触发的免疫反应(effector-triggered immunity，ETI)，主要是通过植物抗性基因编码的抗性蛋白直接或者间接地识别由病原物分泌的效应蛋白，从而触发的一种快速而又强烈的免疫反应[23]。

2.1 PTI反应

PTI在非寄主抗性和基础抗性中起关键作用，保护植物免受各种潜在的病原物的迫害[24]。在植物中，PRRs主要包括类受体蛋白激酶(receptor-like kinases，RLKs)和类受体蛋白(receptor-like proteins，RLPs)。其中，RLKs和RLPs的胞外亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeat，LRR)相似，但不同的是RLKs具有胞内激酶结构域[25]。Fritz-Laylin等[26-27]在日本粳稻基因组中鉴定出了90个RLPs基因，研究表明，这些RLPs可能参与水稻的生长发育和免疫防御信号的转导。RLKs是植物中参与防御相关的信号转导的大基因家族[27]，目前已经定位并克隆了一些与细菌防御相关的RLKs基因，例如AtFLS2[28]和AtEFR[29]。

PAMPs是对于病原体适应性必不可少的保守分子，并且不会存在于寄主细胞中[30]。大多数已知细菌病原物的PAMPs可分为多肽类型或碳水化合物类型。其中，具有多肽特征的PAMPs包括细菌鞭毛蛋白、延伸因子Tu和AxYS22，而具有碳水化合物特征的PAMPs包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和肽聚糖(peptidoglycan，PGN)[31]。研究表明，AtFLS2基因和AtEFR基因编码的RLKs分别是细菌鞭毛蛋白和延伸因子Tu的受体[28-29]。与AtFLS2直系同源的OsFLS2也编码细菌鞭毛蛋白的受体[32]，而水稻的Xa21基因编码的XA21蛋白被鉴定为AxYS22的受体[2]。LPS是革兰氏阴性细菌的外膜糖缀合物，由脂质A、核心寡糖和多糖部分组成，其功能是协调革兰氏阴性细菌的外膜通透性，使细菌在不利的环境中生长[33]。研究发现，植物细胞可能通过不同的受体感知LPS中的糖和脂质结构，从而引发不同的防御反应[34]。尽管LPS受体的分子特征在动物中已经得到了广泛的研究[35-36]，但目前尚未在水稻中识别和鉴定出这些LPS受体。PGN是革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中必不可少的细胞壁成分，可为细菌的细胞提供硬度和结构上的支持[36]。由于目前尚未在真核生物中发现PGN，因此，它被认为是植物基础抗性系统的极佳靶标[37-38]。来源于根癌农杆菌和野油菜黄单胞菌的PGN作为一种多肽型的PAMPs诱导了拟南芥的免疫反应，其中包括诱导ROS的产生、防御相关基因的表达和胼胝质的沉积[39]。在水稻中，LYP4和LYP6基因编码的PRRs是来源于Xoo的PGN受体。破坏其中的任一基因都会大大损害PGN诱导的水稻防御反应，从而导致水稻对细菌病原体的敏感性增加[33]。

丝裂原活化的蛋白激酶级联反应是(mitogen-activated protein kinase cascade，MAPK)植物免疫反应的关键信号通路，在PRRs的下游起作用，可将细胞外刺激转换为细胞内反应[40]。MAPK级联反应至少由3种激酶组成：MAPK激酶激酶(MAP3K)、MAPK激酶(MAP2K)和MAPK[41]。这些酶在高等植物中是高度保守的，在植物的生长发育和防御反应中起着至关重要的作用[42-45]。植物通过PRRs感知到病原物的刺激后，其MAPKKKs被磷酸化并激活下游的MAPKKs，后者又磷酸化并激活MAPKs。活化的MAPK磷酸化特定的下游底物，从而导致植物防御反应的激活[46]。MAPKs级联反应通过调节防御相关基因的激活、抗菌代谢物的合成以及过敏性细胞死亡(hypersensitive response-like cell death，HR)而赋予了植物另一道防御机制[42-45]。例如，AtMPK3和AtMPK6在病原体(flg22和LPS)诱导的气孔关闭中发挥重要作用[47-48]。当病原细菌入侵时，OsMPKK10.2在S304处被未知的激酶磷酸化，随后激活了OsMPK6，经过一系列的信号传递使OsMPKK10.2-OsMPK6信号级联的激活被放大，从而通过积累H2O2等防御反应增强了水稻的抗性[49]。

2.2 ETI反应

尽管水稻能够触发PTI反应，产生一种对多种病原物都有效的基础免疫，但是在植物与病原物共同进化的过程中，病原物也通过产生一些专化性的效应因子规避了这种防御反应，从而导致了植物的效应子触发易感性[50]。植物在遭受病原物无休止的攻击后，也会进化出一些新的抗性基因以求生存。这些抗性基因编码的蛋白可以特异性识别病原物无毒基因编码的效应因子，从而激活ETI[51-52]。迄今为止，已经鉴定出了超过46个基因赋予水稻对Xoo的抗病性，且成功克隆了其中的16个抗性基因[8]。为了进一步理解水稻-Xoo互作的分子机制，暂时将这16个已被克隆的抗性基因根据其编码蛋白的结构和功能分为以下五类：(1)直接或间接感知细胞表面的PAMPs；(2)直接或间接感知细胞内的效应因子；(3)ExectorR基因-针对类转录激活因子效应物(transcription activator-like effectors，TALEs)的启动子陷阱；(4)被动的丧失易感性基因-丧失与宿主互作的关键靶标；(5)其他分子机制。

2.2.1 直接或间接感知细胞表面的PAMPs

在已被克隆的所有抗白叶枯病基因中，Xa21和Xa3/Xa26基因是一类编码类受体蛋白激酶的抗病基因。其中Xa21的抗病相关机制研究的较为清晰，研究表明，XA21可以通过结合ATPase(XB24)、E3泛素连接酶(XB3)、PP2C磷酸酶(XB15)、WRKY62转录因子(XB16)、锚蛋白重复蛋白(XB25)和辅助因子蛋白(XB21)[53-58]等蛋白来调节水稻对Xoo的防御反应。其中，XB15[55]、XB16[56]是负调控Xa21介导的抗病性，而XB24[53]、XB3[57]、XB25[54]和XB21[58]正向调控Xa21介导的抗病性。例如，当没有病原物入侵时，XB24结合在XA21上，利用其ATPase活性促使XA21上某些Ser/Thr位点的磷酸化，从而使XA21蛋白处于非活性状态[53]；当病原物入侵时，XA21在识别PAMPs后从XB24上分离，分离下来的XA21被切割，其被切割的细胞内激酶结构域进入细胞核内发挥功能[53,59]。另外，这些细胞表面的PRRs在识别PAMPs的过程中还需要招募一些额外的LRR-RLKs共受体。其中，OsSERK2是一种LRR-RLKs共受体，参与XA21介导的免疫反应[60]。此外，LRR1与OsSERK2的胞外结构域具有68%的相似性，是XA21介导的免疫反应所必需的[61]。Xa3/Xa26也是编码类受体蛋白激酶的抗病基因，与Xa21属于同一种类型。含有Xa3/Xa26的转基因植物通过增强防御反应相关基因的表达提高了水稻对白叶枯病的抗病性[62]。

2.2.2 直接或间接感知在细胞内的效应因子

为了有效地侵染植物，病原菌会将称为效应因子的蛋白质分泌到细胞外空间或直接分泌到植物宿主细胞中[63]。植物固有的免疫受体包括定位在细胞表面的PRRs以及定位在细胞质或细胞膜的NLR受体[64-65]。PRRs可以识别保守的PAMPs和细胞外效应因子[63,65]，而NLR则是检测感染过程中传递到宿主细胞中的效应因子的存在或活性的[64]。显性主效抗病基因Xa1编码的蛋白产物含有核苷酸结合位点(nucleotide binding sites，NBS)和一种新型的富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich repeats，LRR)，是NBS-LRR类蛋白中的一员[3]。Xa1能够识别病原菌的多种TALEs，当Xoo侵染时，会导致植物木质部薄壁组织细胞形成自噬小体，从而通过自噬性细胞死亡过程来影响水稻对Xoo的抗性[66]。近期已成功鉴定并克隆了4个Xa1的等位基因，分别是Xa2、Xa14、Xa31(t)和Xa45(t)[4,51]。这些等位基因也编码NLR类蛋白，其中Xa1、Xa2和Xa14之间的相互作用在水稻对Xoo的抗病性中起着非常复杂的作用[51]。

2.2.3 ExectorR基因-针对TALEs的启动子陷阱

TALEs通过结合到特定的DNA序列，操纵宿主中的关键感性基因的转录[67-68]。但是在共同进化的过程中，水稻进化出了ExecutorR基因，其启动子可以充当诱饵，模仿这些易感性基因的启动子区域，从而引发免疫反应[68-69]。迄今为止，已经克隆了4个ExecutorR基因，分别是：Xa10、Xa27、XA23和Xa7。它们可以被相应的TALEs(AvrXa10、AvrXa27、AvrXa23和AvrXa7)激活，从而触发ETI[8-9,11]。其中，Xa10基因被AvrXa10特异性诱导表达后[70]，其编码的产物XA10以六聚体的形式定位在内质网(endoplasmic reticulum，ER)膜上，从而通过破坏内质网中维持Ca2+稳态的保守机制来触发程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)[9]。野生稻来源的Xa23与Xa10具有50%以上的序列同源性，该基因启动子区域含有AvrXa23的TALE结合元件(TALE binding element，EBE)，因而能够被Xoo中的AvrXa23特异性的结合并激活转录，使植株产生抗病性。而AvrXa23广泛存在于各种Xoo菌株的生理小种中，因此，含有启动子区域存在EBEAvrXa23元件的Xa23基因的水稻对白叶枯病表现出极广的抗病性[71]。而其易感的等位基因xa23，虽然和Xa23有相同的编码序列，但其启动子区域缺乏EBEAvrXa23元件，无法被AvrXa23激活表达，表现出感病的表型[11]。相比之下，Xa27介导的抗病性是取决于其编码的XA27蛋白在质外体的定位[72]。最新的研究表明，Xa7基因赋予了水稻对白叶枯病的广谱高抗性和持久性。Xoo菌株分泌的AvrXa7和PthXo3可以识别并结合在Xa7启动子中的效应物结合元件上，通过诱导Xa7的表达引发了植物的过敏性细胞死亡反应[8]。

2.2.4 被动的丧失易感性基因的转录-丧失与宿主互作的关键靶标

许多的黄单胞菌属的菌株将其TALEs通过Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system，T3SS)直接注入植物宿主细胞内，进入宿主细胞的TALEs随后易位至细胞核，从而与宿主的易感性基因中的特定启动子序列结合，达到引起植物病害的目的[73-74]。TFIIA作为RNA聚合酶Ⅱ所需的通用转录因子之一，可以与TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH组装成具有转录能力的预起始复合物来启动真核生物中的mRNA合成[74]。其中，Xa5(OsTFIIAγ5)基因编码TFIIA的一个小亚基，对依赖于RNA聚合酶Ⅱ的转录至关重要[75-77]。隐性基因xa5作为Xa5的天然等位基因，其在编码区的第39个氨基酸残基上发生了一个突变，即其缬氨酸(V)残基被谷氨酸残基(E)(V39E)取代[76]。研究表明，xa5的错义突变削弱了TALEs和具有转录能力的预起始复合物之间的相互作用，抑制了相应的易感性基因的转录，从而赋予了水稻对Xoo的抗病性[69,78-79]。但是，在xa5背景下，TALEs对抗病性基因和感病性基因的诱导能力都会被削弱[9,80-81]。除了Xa5，Xoo的TALEs还可以直接靶标在Xa13/OsSWEET11[50]、Xa25/OsSWEET13[82]和Xa41/OsSWEET14[14]基因的相应效应子结合元件(effector binding elements，EBEs)上，通过上调其在水稻中的表达使水稻患病。研究表明，xa13、xa25和xa41(t)基因与其相应的易感性等位基因编码相同的蛋白质，但在其启动子区域具有关键的序列差异。它们通过导致TALEs靶向错误减少其启动子区域与TALEs的结合，赋予了水稻对部分Xoo菌株的抗性[14,82-83]。

2.2.5 其他分子机制

细胞壁相关激酶(cell wall-associated kinase，WAK)基因家族是一个大基因家族，在水稻中至少有125个成员[84]。但是，仅有少数的WAK基因参与植物与病原菌的相互作用[85-86]。其中，Xa4编码一种细胞壁相关激酶，由预测的半乳糖醛酸结合域、钙结合表皮生长因子结构域、跨膜螺旋结构域和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(serine/threonine kinase domain，STK domain)组成[6]。研究表明，Xa4通过促进纤维素合成和抑制细胞壁松弛来增强水稻植株的细胞壁，从而提高了水稻对Xoo的抵抗力[6]。除了从细胞壁这一防线遏制Xoo入侵外，Xa4还可以通过产生植保素来保护水稻免受Xoo的迫害[6]。

3 小结和展望

植物的抗病性与病原物的致病性都不是一成不变的，植物与病原物处于一个长期协同进化的过程中。水稻与Xoo之间的协同进化的动态变化规律也遵循Jones[23]提出的Z字形模型。在进化的过程中，改变抗病基因可识别的无毒基因并进化出新的毒力因子是Xoo逃避和抵消水稻免疫力的2种常见机制[87]，而植物则是通过进化出PTI和ETI 2层免疫系统抵御病原物的入侵。

随着水稻白叶枯病抗性基因作用机理的深入研究，极大的加速了水稻白叶枯病抗性育种的进程。近年来，已经有不少抗病基因被成功应用到水稻的抗病育种中。但是，由于很多抗病基因表现出很强的小种特异性，而这些抗病性会随着病原菌小种间的变异而发生变化，从而导致其产生的抗性在生产应用上难以长久维持。而发掘新种质、创制抗病新材料、培育抗性新品种，被认为是提高粮食产量和保证粮食安全生产的最经济有效的方法。其中，培育水稻抗病新品种的基础在于利用优质种质资源，成功的关键在于准确选择合适的广谱高效的抗病基因进行改造。野生稻作为一种能够长期在野生状态下生存的水稻，在与病原物的长期协同进化过程中进化出了大量的抗性基因，是水稻抗病基因资源挖掘的宝库。因此，综合运用现代分子生物技术手段挖掘这些基因资源，利用基因编辑等新技术研究相应的抗病基因功能，采用体细胞杂交、分子标记辅助等方法，创制新型的种质资源，选育抗病新品种，对于实现水稻高产稳产以及安全生产具有直接的现实意义。