干扰素刺激基因15（ISG15）在天然免疫中的抗病毒作用研究进展

嵇祝星 王晓泉 刘晓文 刘秀梵

（扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225000）

1 ISG15概述

干扰素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）最初于1979年在IFN处理后的细胞中被发现，这种蛋白在合成之初表现为17 kD的前体形式，但随后被水解为15 kD的蛋白，因此被命名为“15 kD蛋白”。1987年，在发现其转录由IFN-β驱动后，将其更名为“ISG15”［1］。晶体结构显示，ISG15由2个类泛素（UBL）结构域组成，各结构域中均含有4个β-折叠和1个α-螺旋，2个结构域由1个被称为“铰链”的多肽序列连接［2］。值得注意的是这2个UBL结构域N端和C端末端氨基酸序列分别与泛素具有29%和31%同源性。

2 ISG15的修饰作用

ISG15的细胞内作用与泛素相似，目前对ISG15的研究表明，尽管未结合（游离）的ISG15也有多种功能，但其作用主要通过与赖氨酸（K）残基结合实现。ISG15存在17 kD前体，通过蛋白水解加工为15 kD的成熟形式，加工后暴露ISG化所需的羧基末端的LRLRGG基序［3］。ISG15通过这个基序与目标蛋白共价连接，这一过程称为ISG化（ISGylated）。ISG化需要三步酶级联反应，包括E1激活酶（Ube1L）、E2结合酶（UbcH8）和E3连接酶（Herc5或TRIM25/EFP）。ISG化可被泛素特异性蛋白酶18（USP18）逆转［4］。USP18与ISG15一样，也是众多IFN刺激基因下游的产物。ISG15作为类泛素样蛋白与泛素的不同体现在泛素具有数百种可用于形成复杂多聚泛素链的E1-E2-E3酶，ISG15仅有一组数量有限的E1-E2-E3酶介导其单体连接至目标蛋白。ISG化发生位置主要在核糖体，但由于主要的ISG15 E3-连接酶（Herc5）定位，所以ISG化很大程度上发生于新合成的蛋白［5］。

3 病毒ISG化修饰

ISG15 E3连接酶（Herc5）主要位于核糖体，因此，病毒感染期间，活跃的翻译蛋白如病毒蛋白优先被ISG化。病毒蛋白ISG化可干扰其定位、蛋白酶活性，破坏其与宿主蛋白或其他病毒蛋白相互作用，破坏其自身寡聚和几何结构，或影响其他功能，最终导致病毒复制减少或宿主免疫应答改变。

流感病毒NS1蛋白是最早被报道的ISG化病毒蛋白［6］。NS1对病毒复制至关重要，可抑制Ⅰ型IFN［7］。A型流感病毒（influenza A virus，IAV）NS1（NS1/A）的ISG化阻止其形成同源二聚体，其中第41位赖氨酸（K41）修饰破坏NS1与Importin-α相互作用，从而抑制NS1核转位，使病毒易受IFN抑制［6］。研究发现，IAV的NS1可被ISG15在7个赖氨酸（K20/41/108/110/126/217/219）上修饰，Herc5可通过其HECT结构域特异性催化ISG化反应。此外，NS1/A在不同位点的ISG化干扰其与RNA靶标结合，包括U6 snRNA、dsRNA、PolyA RNA和病毒RNA。而IAV在ISG15基因敲除的A549细胞中繁殖能力增强［8］。

ISG15在小鼠模型中显示出强大的抗B型流感病毒活性［9］。ISG15-/-小鼠更易感染IBV，证实ISG化抑制B型流感病毒复制［10］。但与IAV不同的是，B型流感病毒中核蛋白（nucleoprotein，NP）是ISG15的主要靶标。ISG15可作为NP寡聚化抑制剂，使其无法形成病毒核糖核蛋白（vRNP），并导致病毒蛋白合成和病毒复制减少［11］。

此外，柯萨奇B3病毒（CVB3）2A蛋白酶的ISG化抑制其在心肌细胞中切割真核起始因子eIF4G蛋白的能力，从而阻止“宿主关闭”现象，因此，ISG15与CVB3结合可降低病毒滴度，限制炎症性心肌病和心力衰竭［12］。ISG化也抑制人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）基因表达和病毒粒子释放。HCMVpUL26蛋 白可 抑 制TNF-α诱 导的NF-κB活化［13］。pUL26蛋白的ISG化改变了pUL26稳定性，并抑制其抑制NF-κB信号的能力［14］。

ISG化对登革热病毒2型（DENV-2）复制起抑制作用。过表达ISG15可显著抑制细胞外病毒释放，但对细胞内病毒RNA无影响，且ISG15过表达可降低细胞外病毒感染力。研究显示，IFN处理的细胞中DENV-2 RNA水平显著降低，并可在ISG15基因敲除后部分恢复，主要由于DENV-2蛋白中NS3和NS5发生ISG化抑制DENV-2颗粒释放，因此，ISG15可作为宿主抗病毒因子对抗DENV-2感染［15］。

ISG15在抑制伪狂犬病病毒（PRV）时也发挥重要作用。研究表明，PRV感染早期，过表达ISG15可通过降低病毒滴度和其mRNA水平有效抑制PRV复制，从而增加IFN-β表达，激活ISRE启动子并上调IFN诱导的信号转导。说明ISG15在细胞抗PRV反应中具有潜在免疫调节作用［16］。以上结果表明病毒蛋白ISG化作用可降低病毒后代生产效率和质量，并限制病毒蛋白调节宿主免疫应答的能力。

4 宿主蛋白ISG化修饰

除通过直接对病毒蛋白进行ISG化修饰外，对病毒释放所需的宿主蛋白进行修饰也可有效防止病毒产生。

ISG15可抑制艾滋病病毒（HIV）释放。将表达ISG15的质粒与HIV-1病毒共转染可抑制HIV-1释放，但对HIV-1病毒蛋白表达无影响［17］。Gag蛋白是HIV-1出芽和释放所必需的蛋白，ISG15表达抑制HIV-1 Gag蛋白泛素化，破坏其与TSG101蛋白相互作用。也有研究发现，半完整的细胞系统中，IAV血凝素蛋白转运被ISG化的TSG101所抑制［18］。抵抗HIV感染过程中，ISG15可降解由USP18的蛋白酶活性积累导致错误折叠的p53。相反，缺少ISG15可导致错误折叠的负显性p53积累，从而增强HIV-1复制。说明错误折叠p53的ISG化清除对抵抗HIV感染具有重要意义［19］。

此外，ISG15还可与泛素连接酶Nedd4结合，当ISG15与VP40共表达时，可抑制埃博拉病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）释放。由于埃博拉病毒VLP释放需要宿主NEDD4（泛素蛋白连接酶）介导基质蛋白VP40泛素化，而ISG15可通过影响NEDD4与泛素E2结合酶相互作用从而阻断VP40泛素化［20-21］。

最近一项关于非洲猪瘟病毒（CSFV）的研究发现，IFN-α处理后诱导ISG15上调可抑制CSFV复制。此外，上调的ISG15可促进Beclin-1的ISG化和功能障碍，从而抑制自噬，而自噬是CSFV复制所必需 的。此 外，HERC5的HECT和RLD结 构 也 与BECN1相互作用，催化ISG15蛋白与病毒结合［22］。

5 ISG化影响宿主信号通路调节

蛋白质组学研究已确定数百种在干扰素刺激后可被ISG化的宿主蛋白［23］。这些研究大多表明ISG15结合可影响参与免疫调节的重要信号通路，如IFN、NF-κB、JNK通路。其中ISG化可通过延长信号蛋白如IRF3、STAT1激活状态增强抗病毒信号通路，导致Ⅰ型IFN和ISGs表达增加［24-25］。

干扰素调节转录因子3（IRF3）是调节Ⅰ型IFN反应的关键转录调节因子，也是ISG15的靶标之一［26］。IRF3一旦被磷酸化就会从细胞质移动至细胞核，与CREB结合蛋白形成复合物，激活IFN-α/β和ISGs转录［27-28］。ISG15与IRF3结合抑制蛋白酶体对ISG15的降解，导致人类细胞中更强大的IFN反应［24］。仙台病毒（SeV）感染过程中，IRF3被ISG化，抑制其与PIN1（肽基脯氨酰顺反异构酶）相互作用，并阻止IRF3泛素化和降解［24］。

STAT1是STAT蛋白家族成员，作为转录因子参与Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型IFN诱导基因上调。STAT1在人源细胞中被ISG化，可维持已磷酸化的STAT1（pSTAT1）表达，且ISG化抑制其泛素化和进一步蛋白酶体降解，使STAT1可持续活化介导更强大的干扰素反应，限制病毒复制［29］。

虽然ISG15在维持和激活抗病毒免疫中起正向调节作用，但其也可对抗病毒信号通路起负反馈抑制作用，防止过度免疫反应。RIG-Ⅰ是一种RNA传感器，可释放信号激活IRF3和NF-κB。ISG15与RIG-Ⅰ结合降低小鼠细胞中Ⅰ型IFN启动子活性，减少NF-κB反应［30］。此外，游离的ISG15还通过促进RIG-Ⅰ与p62相互作用调节RIG-Ⅰ水平，并通过选择性自噬介导RIG-Ⅰ降解［30-31］。ISG15在NF-κB信号传导途径上与Ubc13结合，Ubc13是一种泛素结合酶，参与TAK1（转化生长因子β激活激酶1）泛素化［32］。ISG15抑制TAK1泛素化导致NF-κB途径负调节［33］。

ISG15可与细丝蛋白B（Filamin B）结合，细丝蛋白B作为RAC1、mekkk1、MKK4和JNK的支架蛋白，可促进IFN信号传导，而ISG15与Filamin B结合阻止该支架形成，从而减少IFN反应［34-35］。

ISG15还可与蛋白激酶R（PKR）结合。PKR是一种IFN诱导的蛋白激酶，由双链RNA激活，但在无病毒RNA情况下可被ISG15激活［36-37］。已知激活的PKR通过磷酸化eIF2a（真核启动因子2α）抑制蛋白翻译，IFN或脂多糖刺激后PKR的ISG化发生于K69和K159，ISG化的PKR表现出不依赖RNA的结构性激活，最终导致细胞中蛋白合成减少［37］。

6 ISG15作为免疫调节细胞因子

ISG15除可发挥ISG化修饰作用，也可作为一种免疫调节细胞因子分泌至细胞外发挥作用。

采用抑制剂探究ISG15分泌途径发现，ISG15由高尔基复合体分泌，而非由人类多药抗性蛋白分泌［38］。中性粒细胞颗粒是潜在分泌ISG15的途径，因为中性粒细胞可产生几种对初始炎症反应非常重要的细胞因子和趋化因子［39］。研究发现，中性粒细胞中，ISG15定位于明胶酶和分泌物，表明粒细胞可能是ISG15的分泌途径［40］。

TLR3激活的人脑微血管内皮细胞释放的外泌体中也发现了ISG15。初级巨噬细胞可内化这些外泌体，导致ISG在转录水平和翻译水平增加［41］。重要的是，即使没有Ⅰ型IFN诱导，中性粒细胞、单核细胞、T细胞、cDC、pDC和NK细胞均有ISG15蛋白组成性产生，表明其在生理环境中产生ISG15，并能够分泌ISG15［40］。

ISG15一旦分泌就可调节不同免疫细胞功能。研究证明，ISG15增加了LPS对原代单核细胞的细胞毒性，并可诱导IFN-γ产生，一项对ISG15缺乏症患者的研究中证实了这一点，该缺乏症患者对分枝杆菌感染的易感性增加［42］。

进一步实验表明，ISG15与IL-12协同作用刺激PBMC释放IFN-γ，其刺激效应显著的是自然杀伤（NK）细胞，其次是T细胞［43］。通过突变ISG15表面残基，发现在C端泛素样结构域上有1个对诱导IFN-γ分泌起关键作用的小“补丁”，称为“IFN-γ补丁”，可介导ISG15与NK-92细胞表面稳定结合。之后采用泛素激活的相互作用陷阱技术（UBAITs，一种利用泛素系统的生物化学特性捕获瞬时蛋白相互作用的方法）鉴定ISG15受体，证明LFA-1（CD11a/αL和CD18/β2整合素的异源二聚体）是ISG15受体，ISG15直接与其CD11a亚基结合［44］。该研究还指出ISG15对细胞因子分泌的影响并不局限于IFN-γ，因为ISG15还可诱导NK-92细胞分泌IL-10。重要的是，虽然ISG15介导的上游信号传导已被初步鉴定，但下游介导细胞因子分泌的过程尚未确定。此外，能够分泌ISG15的细胞类型及分泌机制也尚未阐明。

7 ISG15物种特异性对抗病毒效应的影响

研究发现，ISG15-/-患者表现出Ⅰ型IFN自身炎症，而这一表型与ISG15-/-小鼠形成鲜明对比，表明ISG15型在不同物种间可能具有不同功能［45］。ISG15序列多样性已被证明其影响一些病毒与机体反应。

ISG15序列在不同物种间具有高度变异性，最极端情况下，如在一些哺乳动物和鱼类间，ISG15序列同源性仅为30%~35%。即使在2种不同哺乳动物之间，序列同源性也低于60%［46］。从另一个角度看，可能解释了人类和小鼠ISG15与USP18结合能力差异的原因［45］。人ISG15与USP18的结合能力比小鼠ISG15更强，因此USP18在人类细胞中不被降解。

从抗病毒功能角度来说，ISG15与B型流感NS1蛋白（NS1/B）相互作用具有物种特异性。与其他物种ISG15相比，NS1/B与人ISG15结合比小鼠、牛和犬更加稳定，表明NS1/B蛋白可能是决定B型流感病毒宿主敏感性的主要因素［47］。采用反向遗传方法研究发现，仅ISG15铰链区内关键残基突变就足以显著影响其结合特性［48］。将人ISG15中的2个关键残基（D76和K77）与小鼠、犬和牛ISG15中的相应残基进行交换，将其与NS1/B结合降低至Western blot几乎检测不到的水平。相反，交换使小鼠、犬和牛ISG15结合能力均有所增加，可以解释不同物种对B型流感病毒感染的不同细胞表型的问题，表明ISG15铰链区可能是影响NS1/B宿主特异性的主要因素［49］。

此外，研究揭示奈罗病毒vOTUs和冠状病毒PLPs均对不同物种的ISG15表现出不同的切割能力和物种亲和性差异［50-51］。

ISG15的非保守性及病毒与不同种属的ISG15分子作用效果差异，提示探究病毒与ISG15分子互作前，需要对每个物种ISG15进行序列分析，寻找关键差异位点。更需要预测结构上的差异，如小鼠和人类ISG15间除表面结构变异外，其各自的Ub样结构域朝不同方向弯曲［50］。表明其物种间差异可能不仅是简单的表面片段置换，还可能包括ISG15结构域间相互作用。

8 结论与展望

ISG15在介导和调节宿主天然免疫反应对抗病毒感染时具有重要作用。目前，对ISG15发挥作用的形式和功能的研究已有初步理解，一是发挥ISG化修饰作用，针对病毒本身或病毒复制所需要的宿主蛋白进行；二是ISG化修饰先天免疫信号通路中的关键分子，既可正向也可负向调节通路信号传递；三是作为免疫调节细胞因子，发挥ISG15单体生物学效应，能够与受体LFA-1相互作用触发IFN-γ产生和其他信号通路，表明其是一种潜在的细胞因子。最重要的一点是不同物种ISG15与不同病毒的作用机制可能不同，显示ISG15在体内发挥作用的多元性和复杂性，其中多个方面进行了进一步研究，如作为机体对抗病原体入侵的手段，蛋白ISG化修饰谱具体范围是什么？ISG化如何调节病毒蛋白、病毒复制和宿主内稳态仍然知之甚少。此外，对其作为细胞因子或是单体ISG15的分子作用机制及其对其他细胞调节能力的探究仍处于起步阶段。ISG15作为一个非高保守性蛋白，物种间和种内差异较大。确定蛋白ISG化的物种特异性结合偏好、范围和潜在生物学意义将有助于理解先天性免疫应答。