miRNA 在缺血性脑血管病中作用的研究进展

梁紫君张雪儿黄 健张林杰安红伟∗

(1.柳州市中医医院神经内科,广西 柳州 545001;2.广西中医药大学研究生院, 南宁 530000)

随着人口老龄化的加剧,缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease, ICVD)的发病率正在上升,是造成人类残疾和死亡的重要原因之一,严重影响患者的生命健康。 ICVD 是指由于脑血管狭窄或闭塞等各种原因导致脑组织低灌注和缺血缺氧,进而出现神经功能损害的一类疾病。 脑缺血可引起多种缺血性脑病(如缺血性脑卒中、短暂性脑缺血发作等)的发生,其中缺血性脑卒中最为常见,占所有脑血管意外的87%[1-2]。 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是ICVD 的主要病理基础,而脑侧支循环的建立对该疾病的恢复具有重要的作用。 miRNA 在ICVD 的发病机制中起着重要的调节作用,与动脉粥样硬化、侧支循环等密切相关,是近年来生物医学领域是研究热点之一[3]。 已有研究表明,miRNA 与ICVD 脑缺血损伤的炎症反应、氧化应激、自噬、细胞凋亡等生理病理过程密切相关[2]。 本文就miRNA 在ICVD 脑血管AS 的炎症机制及其侧支循环建立中的调控作用进行综述,为探索ICVD 的防治提供新思路。

1 miRNA 简介

miRNA 是一类长度约22 个核苷酸的、具有高度保守性的内源性非编码单链RNA 分子,能够通过序列配对结合到靶基因mRNA 的3’-非翻译区(3’-UTR)上,发挥降解靶基因mRNA 或者抑制其翻译的作用,从而参与转录后基因表达调控,广泛存在于动植物、真菌及病毒中[4]。 miRNA 可以通过与相应靶基因结合而调节炎症反应等多种机体生理病理过程,是近年来生物学研究领域的重大突破。 许多研究表明,miRNA 在肿瘤发生、斑块形成、细胞生长、分化和血管生成等过程中发挥着重要的调节作用,与动脉粥样硬化、缺血性脑卒中、癌症、心血管疾病等疾病的发病机制有着显著的相关性;而且miRNA 既能在细胞或组织中特异性表达,又能稳定存在于血液中成为循环miRNA,具有作为早期疾病诊断和病情评估的新型血液生物标志物的巨大潜力[5-8]。

2 miRNA 通过介导炎症反应参与ICVD 中的动脉粥样硬化过程

动脉粥样硬化(AS)是一种血管的慢性炎性疾病,其特征是由于过多的脂质和炎性细胞累积于血管壁形成斑块而导致血管腔狭窄。 AS 是ICVD 发病的重要危险因素之一,是预防和治疗ICVD 的关键所在[9]。 许多研究发现,miRNA 参与调节AS 的血管内皮损伤、不稳定斑块的破裂及血栓形成等过程,从而导致脑血管狭窄诱发ICVD。 内皮细胞功能障碍是AS 的的最初触发机制[10],这一点已得到普遍 认 可。 Liang 等[11]通 过 建 立 载 脂 蛋 白 E(ApoE)-/-基因敲除小鼠的AS 模型,发现miR-155可以通过靶向抑制脑和肌肉ARNT 样蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein-1, Bmal1)诱导内皮细胞凋亡和炎症反应,促进AS 的发展。 此外,miRNA也可以通过调节白细胞介导的炎症反应来参与AS疾病的进展。 miR-21 是巨噬细胞中表达最丰富的miRNA,巨噬细胞中miR-21 的缺失可以增加炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达,促进AS 形成期间的斑块坏死和血管炎症[12]。 因此,miRNA 可以通过调节炎症反应参与AS 的形成、发生发展等过程,从而诱导ICVD 的发生。 已有多项研究表明,miRNA 是基因表达转录后重要的调控因子,可以通过多种炎症信号通路调控AS 的炎症应答过程,从而参与AS 的演进。

2.1 核因子-κB(NF-κB)信号通路

NF-κB 是一种促炎转录因子,在无刺激条件下,与κB 抑制物(IκB)相互作用被隔离在细胞质中;当受到炎症信号刺激时,IκB 激酶(IKK)复合物磷酸化IκB 导致其蛋白酶体降解,因而NF-κB 得以释放进入细胞核并与细胞黏附分子、促炎细胞因子、趋化因子等促炎基因结合,从而介导AS 的炎症反应过程。 NF-κB 途径是引起炎症的主要途径,许多miRNA 可通过NF-κB 途径参与血管炎症和炎性疾病(如AS 和败血症)的调节[13]。 有研究表明,MiR-181a-5p 和miR-181a-3p 分别通过靶向TAB2 和NEMO 来阻断NF-κB 信号通路的激活,抑制人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中的黏附分子表达以及单核细胞与内皮细胞的相互作用,协同缓解高血脂应激引起的血管炎症,从而延缓AS 的病理进展[14]。 Dong 等[15]通过对缺血性脑卒中大鼠模型和体外模型进行研究,发现miRNA-22 可以通过p38 MAPK/NF-κB 途径减轻缺血性脑卒中诱发的炎症反应。 另外,Wei 等[16]通过分析miRNA 在氧化性低密度脂蛋白(oxidative low-density lipoprotein, ox-LDL)诱发的HUVECs 活化中的生物学活性,发现MiR-345-3p 通过靶向内皮细胞中的TRAF6 抑制TAK1/p38/NF-κB 信号通路的激活,从而减轻了由ox-LDL 引起的细胞凋亡和炎症反应。 因此,miRNA 可通过阻断NF-κB 信号通路,参与抑制AS 的炎性反应过程。

2.2 Toll 样受体4(TLR4)信号通路

Toll 样受体4 信号通路在AS 的炎症激活和脂质积聚过程中起着重要作用,可以激活转录因子NF-κB 而导致各种炎症因子的产生[17],而miRNA可通过TLR4 信号通路参与AS 斑块中的脂质积累和炎症反应。 有研究发现,在ox-LDL 诱导THP-1巨噬细胞的体外实验中,TLR4 的表达以时间和剂量依赖性方式显著增加,miR-370 的表达则以相同的依赖性下降,该研究证实miR-370 可通过靶向THP-1 巨噬细胞中的TLR4 来减少ox-LDL 触发的血管炎症和氧化应激[18]。 有研究者通过利用脂多糖(LPS)建立内皮细胞炎症损伤模型,发现LPS 可显著上调miR-146a 的表达,证明了miR-146a 以TLR4依赖的方式负调节LPS 诱导的CXCL16 表达,从而抑制动脉粥样硬化中的炎症反应[19]。 以上研究表明,TLR4 信号通路的激活可促进AS 炎症的发生发展。

2.3 Notch 信号通路

Notch 通路是由4 种Notch 受体亚型(Notch 1-4) 和5 种 Notch 配 体(Delta-like ligand 1/3/4(DLL1/3/4)、Jagged-1/2)组成的介导细胞间信息交流的信号系统,在AS 的炎症和免疫调节中起着重要的作用[20]。 Sun 等[21]研究发现,Notch 1 作为miR-181b 的直接结合位点,在AS 模型鼠中表达上调,而miR-181b 表达下调;miR-181b 表达的下调是通过调节Notch 1 机制引起AS 炎症和血管内皮损伤的重要因素。 另一项相关研究报道,在ApoE-/-基因敲除小鼠模型中miR-181b 可通过直接靶向Notch1 调节巨噬细胞极化,从而拮抗AS 斑块的易损性[22]。 Gao 等[23]通过建立冠状动脉粥样硬化小鼠模型,发现miR-107 可通过靶向KRT1 来抑制Notch 信号途径的激活,拮抗血管内皮细胞的炎症和内质网应激,从而发挥预防血管AS 发生的作用。由此可见,抑制Notch 信号通路对减少AS 炎症反应具有一定的作用。

2.4 其他信号通路

一项研究通过荧光素酶报告基因分析证实,一氧化氮合酶3(NOS3)是miR-195 和miR-582 的直接靶标;而miR-195 和miR-582 的上调可通过靶向结合NOS3mRNA 的3’-UTR 来抑制内皮细胞中NOS3的表达,从而减少NO 的释放,防止血小板的活化、黏附和聚集,从而抑制血栓的形成[24]。 在另一项研究中,经ox-LDL 诱导的树突状细胞中miR-155 表达上调,miR-155 可通过抑制JNK 信号负调控清道夫受体A(scavenger receptor A, SRA)的表达,该研究阐明了miR155-JNK-SRA-miR-155 负反馈环是ox-LDL 调控miR-155 表达的分子机制[25]。 Tang 等[26]研究发现,经ox-LDL 处理的HUVEC 中miR-126 表达显著降低,而给予miR-126 模拟物可明显阻断ox-LDL 诱导的HUVEC 损伤;该研究表明miR-126 通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路恢复细胞自噬功能,减轻AS 的内皮损伤。 以上研究结果说明,miRNA 可以通过多种信号通路参与AS 炎症调节。

3 miRN 通过调控血管新生参与ICVD 侧支循环的建立

脑侧支循环是指当脑动脉发生狭窄甚至闭塞或者其他原因而导致正常脑供血受限时,能够代偿灌注脑缺血区的辅助血管结构。 脑侧支循环可分为三级:一级侧支循环是指Willis 环;二级侧支循环包括眼动脉、软脑膜动脉及其他颅内外远端动脉之间建立的吻合支;三级侧支循环为缺血区周围形成的新生血管[27]。 脑侧支循环对ICVD 疾病的发生发展、治疗及预后有着重要的影响。 Marks 等[28]在研究侧支循环对接受血管内治疗的急性脑梗死患者的影响中发现,侧支循环良好患者的NIHSS 评分、脑梗死体积以及溶栓后再灌注情况均显著优于侧支循环不良患者,且脑梗死再灌注及侧支循环均不良者更易发生脑梗死体积的扩大。 越来越多研究表明,miRNA 与ICVD 侧支循环建立也有着密切的关系。

一级、二级侧支循环是生理存在的脑动脉,当它们无法维持脑组织的正常血供,动脉之间将会建立新生血管之间的吻合,即三级侧支循环。 miRNA不仅参与ICVD 的AS 炎性调控过程,同时也在缺血后脑血管的再生中发挥着重要作用。 血管生成是一个复杂且高度调控的过程,包括内皮细胞活化、增殖、迁移、发芽,基底膜形成以及新生血管的成熟等步骤[29],是ICVD 生理功能恢复的重要因素。 多项研究表明miRNA 具有调控血管新生的作用。 Fan等[30]通过建立大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)小鼠模型,发现miR-384-5p可以负调节DLL4 的表达,通过Notch 信号通路促进缺血性脑卒中小鼠内皮祖细胞的增殖和血管生成,同时抑制内皮祖细胞的凋亡。 而Zhang 等[31]研究发现,胆固醇修饰的miR-210 可以显著上调MCAO小鼠模型脑缺血病变区域的整合素β3、CD34(内皮细胞标记物) 和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,从而促进缺血性脑损伤区域的血管生成。 另一项研究证实,miR-26a 可以通过PI3K/AKT 和MAPK/ERK 途径上调低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,介导VEGF的转录活性并促进脑微血管内皮细胞的管腔形成和细胞增殖,从而促进脑梗死大鼠模型的血管生成[32]。 以上研究结果表明,miRNA 可以通过介导Notch 信号通路与VEGF 信号通路促进新生血管形成,从而参与ICVD 侧支循环的形成过程,改善缺血缺氧造成的脑损伤。

4 miRNA 在ICVD 中的潜在应用价值

4.1 循环miRNA 作为ICVD 诊断、治疗、预后的潜在生物标记物

多项证据表明,血液中多种循环miRNA 的表达水平在ICVD 发生后出现差异性变化,有可能成为新的诊断性生物学标记物[33-34]。 Tiedt 等[35]通过对急性脑梗死(acute ischemic stroke,AIS)患者和健康对照受试者血浆样本中的循环miRNA 进行综合评估,发现循环系统中的miR-125a-5p、miR-125b-5p 和miR-143-3p 与AIS 有关,具有显著的敏感性(85.6%)、特异性(76.3%)和更高的曲线下面积(AUC)值(0.90);而常规诊断的多模式头颅CT 扫描的敏感性及神经元特异性烯醇化酶、白细胞介素6 的AUC 值均明显低于这3 种miRNA。Chen 等[36]研究发现循环外泌体miR-223 的增加与AIS 的发生、严重程度和短期预后相关,AIS 患者发病72 h 内外周血外泌体miR-223 的表达水平显著高于健康对照者,且增高水平与美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分呈正相关;随访3个月,miR-223 高表达的AIS 患者预后较差。Huang 等[37]对颈动脉粥样硬化( carotid atherosclerosis, CAS)患者外周血中的miRNA 和促炎因子的表达水平进行研究,发现CAS 患者miRNA-146a 和促炎因子(肿瘤坏死因子α 和白介素6)的表达水平有统计学差异,并且与CAS 狭窄程度及斑块易损性呈正相关。 Wu 等[38]通过采用高通量TaqMan 低密度阵列(TLDA)筛选技术和个体定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测方法进行一项病例对照研究,发现短暂性脑缺血发作(TIA)和缺血性脑卒中(IS) 患者的某些循环miRNAs 有着独特的表达特征;TIA 患者血清miR-23b-3p、miR-29b-3p 和miR-181a-5p 表 达 显 著 上调,而IS 患者血清miR-21-5p、miR-23b-3p、miR-29b-3p 和miR-181a-5p 表达显著上调,其中miR-21-5p、miR-23b-3p 和miR-29b-3p 在TIA 和IS 患者血清中存在差异性表达,这对ICVD 的疾病鉴别具有重要的意义。 此外,该研究团队还发现这些循环miRNAs 的表达水平对TIA 后继发卒中风险和IS 的神经功能缺损严重程度密切相关。 这些临床研究结果表明,循环miRNA 对缺血性脑血管病的诊断和病情预测具有重要的潜在价值。

4.2 循环miRNA 作为评估ICVD 侧支循环建立情况的潜在生物标记物

循环miRNA 分子有可能作为预测ICVD 患者侧支循环建立的标记物。 Jin 等[39]通过研究促血管生成和抗血管生成的miRNA 在AIS 患者中的表达情况,结果显示与对照组相比,AIS 患者外周血中的miRNA-126、miRNA-130a 和miRNA-378 表达均降低,而循环miRNA-185、miRNA-218 和miRNA-222均表达升高;此外,miR-101、miR-126、miR-206、miR-218、miR-222 和miR-378 与NIHSS 评分相关,可用于评估AIS 的疾病严重程度。 范崇桂等[40]通过探讨AIS 患者血清miRNA 表达水平与脑侧支循环建立的关系,发现AIS 患者的血清miR-7、miR-200b 表达水平较健康对照组有差异性降低,且在不同分级侧支循环的患者中存在显著差异,三级侧支循环组血清miR-7、miR-200b 水平明显低于一级、二级侧支循环组,这提示血清miR-7、miR-200b 水平有望用于患者侧支循环建立情况的预测,为临床制定合理的治疗策略提供参考作用。 彭彬等[41]通过对80 例AIS 患者的循环miRNA 水平进行研究发现,脑侧支循环不良组抑制血管新生的循环miR-15b、miR-92a表达水平显著高于良好组;而脑侧支循环良好组促血管新生的循环miR-126、miR-132、miR-210 较不良组表达显著上调,表达均具有统计学差异性。 这提示AIS 患者体内促血管新生的miRNAs 水平的升高有助于脑侧支循环的建立,较高水平的促血管新生的miRNAs 表达可能是脑侧支循环建立的必要条件。 Wu 等[42]研究发现,AIS 患者血浆miR-99b 水平与VEGF 水平呈负相关,提示miR-99b 下调可能参与脑梗死后脑组织新生血管形成过程。 综上所述,相关循环miRNAs 的表达水平对了解ICVD 患者脑侧支循环建立的情况具有重要的预测价值。 由此猜测,对某些特定的miRNAs 进行调控,及提高促血管生成的miRNAs 表达和减少抗血管生成的miRNAs 表达,可为临床ICVD 的治疗提供新思路。

5 结语

miRNA 参与ICVD 的动脉粥样硬化炎症和血管新生等过程,在ICVD 疾病的发生发展及侧支循环建立中发挥着重要的调节作用。 同时由于miRNA可稳定存在于循环血液中不易被降解,因此具有作为ICVD 诊断性生物学指标的潜力。 目前,虽然对miRNA 与ICVD 的关系的相关研究已经取得一定的成果,但miRNA 在ICVD 生理病理过程中的作用机制有待进一步阐明,在临床的应用仍具有一定的局限性。 对miRNA 在ICVD 中的分子生物学机制进行深入研究,积极寻找有效的生物分子标志物和治疗靶点,具有重要的临床价值。 总之,miRNA 作为ICVD 发生发展过程中的一种新型调控因子,为其发病机制的研究提供了新的思路,并在其诊疗及预后判断等各方面显示出良好的临床应用前景。