肿瘤中HAGLR 反义长链非编码RNA 的表达与机制研究

刘 浪王海存刘广麟高 欣赵俞乔姜兴明

(哈尔滨医科大学附属第二医院,肝胆胰外科,哈尔滨 150086)

长链非编码 RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200 个核苷酸的非编码RNA,由于在转录本上缺乏开放阅读框和保守密码子,lncRNA 基本不具有编码蛋白的能力[1-3]。 随着研究的深入,越来越多的证据表明lncRNA 参与调节染色质重塑、转录后调控、蛋白质翻译和组蛋白乙酰化等生物学过程。 既往研究显示lncRNA 可作为致癌基因或抑癌基因,影响肿瘤的发生和发展[4-13];HAGLR 反义长链非编码RNA(HAGLR opposite strand long non-coding RNA, lncRNA HAGLROS)被证实在多种人类恶性肿瘤中起重要调控作用,可作为临床诊治的潜在标志物和患者的预后评估指标。

1 HAGLROS 概述

HAGLROS 是新发现的长度为699 个核苷酸的长链非编码RNA,主要定位于细胞质。 研究表明HAGLROS 过表达可通过抑制mTOR 介导的P13K/Akt/mTOR 信号通路调控细胞自噬从而促进帕金森氏病的进展;HAGLROS 可靶向miR-20a-5p 调控高糖诱导的心肌细胞的增殖与凋亡;在脂多糖引发的肺炎细胞中,HAGLROS 还可通过miR-100/NF-κB轴调控细胞自噬进而加重炎症损伤[14-16]。 此外,研究显示HAGLROS 在胃癌、肝癌和结直肠癌等诸多恶性肿瘤中呈异常高表达并且存在不同的分子调控机制,探明HAGLROS 在肿瘤中的作用机制将为疾病早期诊断与临床治疗提供新的思路。

2 HAGLROS 与肿瘤

2.1 HAGLROS 与胃癌

Chen 等[17]对84 例胃癌患者肿瘤组织与癌旁正常组织进行实时荧光定量聚合酶链反应

(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测发现HAGLROS 在肿瘤组织中表达更高;数据分析显示HAGLROS 表达水平与癌肿浸润深度、TNM 分期及淋巴结转移密切相关,并且高水平表达的HAGLROS 往往提示预后不良。 体外细胞学实验结果显示:利用小干扰RNA 外源性沉默胃癌细胞中HAGLROS 的表达后,肿瘤细胞的增殖和侵袭迁移能力显著下降。 随后该实验团队通过生物信息学预测发现HAGLROS 与miR-100-5p 及miR-100-5p 与自噬抑制因子哺乳动物雷帕霉素靶点(mechanistic target of rapamycin kinase, mTOR)间存靶向在结合位点;载体构建及双荧光素酶报告基因检测(luciferase)实验证实HAGLROS 可作为竞争性内源RNA 吸附miR-100-5p 来阻断miR-100-5p 对下游基因mTOR 3'-UTR 的靶向作用,进而上调肿瘤细胞内mTOR 的表达(mTOR 蛋白可以形成mTORC1 复合体,通过调控自噬相关基因表达来抑制细胞自噬)。 进一步的实验结果显示:下调胃癌肿瘤细胞内HAGLROS 的表达后mTORC1 活性明显下降且细胞内自噬抑制因子p62 表达水平降低。 上述实验结果提示:过表达的HAGLROS 通过内源性竞争吸附miR-100-5p,促进下游靶基因mTOR 的表达及复合体mTORC1 的形成,从而抑制细胞自噬来促进胃癌肿瘤的发生发展。

2.2 HAGLROS 与肝细胞癌

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,复发率高且预后较差;手术切除作为目前最有效的治疗方法仍存在复发和转移的风险[18-20]。 为探索新的分子诊断标记物和治疗靶点,Wei 等[21]对68 例HCC 患者肿瘤组织及癌旁正常组织进行定量检测及临床病理学数据分析后发现:肿瘤组织中HAGLROS 的表达水平明显更高,并且HAGLROS 的表达水平越高,患者的术后生存时间越短;同时HAGLROS 的表达水平与癌肿分化程度和肿瘤分期存在显著的相关性。深入研究发现:外源性沉默肿瘤细胞(Huh7、MHCC94H 和HepG2.2.15)内HAGLROS 的表达可抑制HCC 的细胞活力,减弱肿瘤细胞的侵袭和迁移;与此同时细胞内caspase-3 等凋亡相关蛋白表达水平明显降低,并且细胞的自噬能力显著增强。 随后的机制研究结果显示:HAGLROS 与miR-5905 及miR-5905 与有自噬抑制效应的自噬相关因子12(autophagy related 12, ATG12)[22]存在相同结合位点;且过表达的HAGLROS 可部分逆转过表达miR-5905 导致的HCC 肿瘤细胞内ATG12 的表达降低。该团队的研究结果提示:过表达的HAGLROS 可通过miR-5905/ATG12 轴抑制HCC 肿瘤细胞发生自噬从而发挥促癌作用。

2.3 HAGLROS 与肝内胆管癌

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是常见的肝胆系统恶性肿瘤,脂质异常积累被认为是影响ICC 发生发展的重要因素,虽然目前肝内胆管癌患者的诊断和治疗取得了一定进展,但晚期患者的预后仍不尽如人意[23-25]。 Ma 等[26]对ICC患者肿瘤组织及癌旁正常组织进行qRT-PCR 检测发现HAGLROS 在肿瘤组织中呈异常高表达。 体外细胞学实验结果显示:外源性下调QBC939 细胞内HAGLROS 的表达后肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显减弱,同时QBC939 细胞中mTOR 通路相关蛋白水平下降且自噬蛋白荧光强度显著升高;当HAGLROS 过表达后,QBC939 细胞内脂质积累增加(TG、LDL-C 和TC 水平明显上升)。 上述实验结果提示:异常高表达的HAGLROS 通过激活mTOR 信号通路来抑制细胞自噬,来对ICC 肿瘤细胞的恶性生物学行为发挥促进作用,并且还可通过增加肿瘤ICC 细胞内脂质积累来促进肿瘤的发生发展。 此外,单多变量和Kaplan-Meier 分析以及ROC 曲线分析结果表明HAGLROS 可作为肝内胆管癌患者独立预后的危险因素,对ICC 患者的早期诊断及临床治疗预后评估具有一定的辅助作用。

2.4 HAGLROS 与结直肠癌

对78 例结直肠癌(colorectal cancer, CRC)患者肿瘤组织与癌旁正常组织的定量检测及临床病理学数据分析结果显示:HAGLROS 在CRC 肿瘤组织中表达更高;HAGLROS 异常高表达提示癌肿恶性程度高且患者术后生存时间短。 Zheng 等[27]的实验团队对此展开研究发现:外源性下调肿瘤细胞内HAGLROS 的表达后,CRC 细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显减弱;并且低表达的HAGLROS 对CRC 细胞自噬有明显的促进作用。 机制研究结果显示:生物信息学预测HAGLROS 与miR-100 和miR-100 与有促癌效应的自噬相关因子5(autophagy related,ATG5)存在靶向作用关系;luciferase 实验结果证实HAGLROS 能够靶向结合miR-100,同时miR-100 与ATG5 也存在靶向位点;并且对肿瘤细胞转染miR-100 mimics 后可部分截制过表达HAGLROS 对ATG5 表达的调控作用(高表达的ATG5 可通过激活mTOR 通路抑制细胞发生自噬,进而促进结直肠癌的发生发展[28-33])及对肿瘤细胞恶性生物学行为的促进作用。 由此可见,过表达的HAGLROS 通过miR-100/ATG5 轴来激活mTOR 通路,抑制结直肠癌肿瘤细胞的自噬进而发挥促癌作用。

2.5 HAGLROS 与骨肉瘤

在骨肉瘤(osteosarcoma, OS)的研究中,Wu等[34]通过对193 例OS 患者肿瘤组织与癌旁正常组织进行qRT-PCR 检测发现HAGLROS 在肿瘤组织中的表达明显更高。 随后收集OS 患者临床病理学数据并建立分析模型:HAGLROS 高表达与OS 癌肿分化程度、TNM 分期和远处转移密切相关;Kaplan-Meier 生存曲线显示HAGLROS 高表达患者的5 年总生存期更短;多变量及Cox 回归模型分析结果表明HAGLROS 可作为骨肉瘤患者独立预后的独立危险因素,提示HAGLROS 可作为骨肉瘤潜在的治疗靶点及预后评估标志物。 此外,Zhou 等[35]同样发现:HAGLROS 在CRC 肿瘤组织和肿瘤细胞内表达明显高于正常组织和细胞;外源性下调骨肉瘤细胞中HAGLROS 的表达后,肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显受抑。 并且随后的生物信息学预测及验证实验结果表明:HAGLROS 可内源性竞争吸附miR-152 来阻断miR-152 对下游促癌因子Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1, ROCK1)的靶向作用,从而上调ROCK1 的表达来增强骨肉瘤的恶性生物学行为。

2.6 HAGLROS 与非小细胞肺癌

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)作为肺癌的主要亚型,近年来发病率有明显上升的趋势[36-37]。 Wang 等[38]对NSCLC 组织样本的qRT-PCR 检测及患者临床病理学数据分析结果显示:非小细胞肺癌肿瘤组织中HAGLROS 的表达更高;高表达HAGLROS 患者癌肿的恶性程度相对更高并且总体术后生存时间更短。 细胞功能学实验结果显示:外源性沉默A549 细胞内HAGLROS后,肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力明显减弱。 为了探究HAGLROS 在NSCLC 中的作用机制,该团队借助生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测实验发现: 野生型 HAGLROS 载体与 miR-152 mimics 共转染后细胞内荧光素强度明显降低,证实HAGLROS 与miR-152 存在靶向作用关系。 进一步验证实验结果表明:转染miR-152 mimics 后,过表达的HAGLROS 对肿瘤细胞A549 恶性生物学行为的促进作用被部分逆转。 后续的研究中Chen 等[39]同样发现:HAGLROS 在NSCLC 肿瘤组织中表达更高;转染特异性siRNA 干扰A549 细胞内HAGLROS 表达后,肿瘤细胞的恶性生物学行为受到明显抑制。随后利用数据库进行相关性分析、构建非小细胞肺癌HAGLROS 表达网络以及对其靶基因功能的分析结果显示:非小细胞肺癌中HAGLROS 通过调控目的基因的表达进而参与剪切体、DNA 复制、细胞周期和染色体分离的调控。 综上所述:过表达的HAGLROS 通过多种调控途径促进非小细胞肺癌的发生发展,并可能成为NSCLC 临床治疗的潜在靶点,对NSCLC 患者的诊断及预后评估有一定的指导意义。

2.7 HAGLROS 与卵巢癌

卵巢癌(ovarian cancer, OC)是女性常见的恶性肿瘤之一,由于进展无明显症状多数患者在确诊时已处于晚期,目前手术切除和化疗是卵巢癌的主要治疗方法但患者预后均不理想[40-42]。 为了探索卵巢癌发生发展的分子机制,Yang 等[43]使用GEPIA数据库分析并对患者肿瘤组织进行定量检测发现HAGLROS 在卵巢癌组织中表达明显更高;患者临床病理学数据的分析结果表明,HAGLROS 高表达组患者的总生存时间显著降低并且HAGLROS 表达水平与肿瘤分期、癌肿浸润深度及远处转移密切相关。 进一步的研究指出HAGLROS 与miR-100 间存在靶向作用:生物信息学预测提示HAGLROS 与miR-100 存在结合位点;TCGA 数据库统计371 例OS 肿瘤样本中miR-100 与HAGLROS 表达呈负相关。 随后实验人员对miR-100 目的基因进行预测和功能分析:miR-100 下游靶基因主要参与调控细胞分解代谢、蛋白多糖生物合成及蛋白酶体泛素降解过程的正向调控;并且目的基因主要富集于MAPK以及调控干细胞多能性的信号通路中;此外,PPI 网络揭示mTOR 与锌和环指2(zinc and ring finger 2,ZNRF2) 为枢纽基因。 上述实验结果指出:HAGLROS 可作为卵巢癌诊断与评估预后的生物学标记物;过表达的HAGLROS 可与miR-100 直接结合来促进mTOR 和ZNRF2 的表达,激活mTOR 通路从而促进卵巢癌的发生发展。

3 展望

在肿瘤之外的研究中,lncRNA HAGLROS 被证实可通过调控多种信号通路,例如:P13K/Akt/mTOR 信号通路和NF-κB 信号通路等影响细胞自噬从而调控疾病的进展。 这些结果为肿瘤中lncRNA HAGLROS 效应的研究提供了新的思路。 随着研究的深入,lncRNA HAGLROS 作为新发现的在诸多恶性肿瘤中呈异常高表达的lncRNA,不仅可通过mTOR 信号通路以及MAPK 信号通路调控肿瘤细胞的自噬过程,还能借助内源性竞争机制结合下游miRNA 来调控靶基因的表达,对肿瘤的增殖、迁移侵袭和自噬等过程产生影响。 此外,诸多临床数据分析结果也提示lncRNA HAGLROS 对肿瘤的诊断及患者预后评估有一定的辅助作用,其因此有成为肿瘤诊疗新的生物学标志物的潜力。 进一步挖掘lncRNA HAGLROS 在肿瘤发生发展中的作用及具体调控机制,将有助于为患者的诊断与治疗提供新的方向。