衰老个体骨骼肌卫星细胞的研究进展

陈昱圻 郭昌龙 袁国红 高建恩 马旭，2

(1国家卫生健康委员会科学技术研究所 国家人类遗传资源中心，北京 100081；2北京协和医学院研究生院)

骨骼肌是由单核成肌细胞融合而成的多核肌纤维组成，肌纤维组织通过收缩产生力量和运动。骨骼肌中含有大量处于静息状态的肌源性干细胞(MDSCs)，位于肌纤维质膜和基底膜之间，被称为卫星细胞，这些细胞对于骨骼肌的再生能力至关重要〔1〕。一旦机体发生损伤，卫星细胞就会停止静息状态，开始增殖，并产生大量肌源性祖细胞，这些祖细胞进一步参与肌源性活动，生成新的肌纤维并取代受损的组织〔2〕。肌纤维的生长、稳态和修复都依赖于卫星细胞，该细胞独特的生长环境使卫星细胞池得以维持，满足骨骼肌功能和修复的需求，但这种肌再生能力在很大程度上受衰老程度的影响，由于衰老机体局部环境发生改变引起骨骼肌功能减弱甚至丧失。

随着人口老龄化发展，在65岁以上的人群中高度流行一种进行性、广泛性的骨骼肌疾病，称为骨骼肌减少症〔3，4〕。临床表现为肌肉质量和功能的加速丧失，导致骨骼肌功能下降，发展到衰弱阶段还会导致跌倒，甚至死亡等不良后果〔3〕，伴随骨骼肌的衰老，其卫星细胞库的规模也在缩小，仅有一小部分卫星细胞在骨骼肌肉中存活到高龄。然而，即使其存在，这些卫星细胞也有功能缺陷，破坏了维持肌肉再生的能力。卫星细胞数量的下降发生在肌肉衰老的早期阶段，由于其微环境的变化和细胞自身内在的改变共同干扰了细胞静止、增殖和凋亡之间的平衡〔5〕。

近几年，肌少症已经成为研究的热点，但肌少症的发病机制复杂，至今仍不明确，尽管自卫星细胞发现以来取得了显著的进展，但研究人员仍在寻找具有产肌能力的替代细胞或药物，从而使患者得到更好的诊断和治疗，为骨骼肌减少症治疗发展提供更好的途径。

1 骨骼肌卫星细胞

1.1骨骼肌卫星细胞的定义 卫星细胞在许多脊椎动物物种中也均有发现〔2〕。1961年，Muaor〔6〕首次从青蛙骨骼肌纤维中分离出来，由于这类细胞位置及排列方式好似肌纤维的卫星，因而得名肌卫星细胞。由于卫星细胞不仅能产生分化的子代，还能通过自我更新来维持自身的种群，故可将其归类为MDSCs。

1.2骨骼肌卫星细胞的标记和识别 在成人骨骼肌中，几乎大部分的卫星细胞都表达成对结构域转录因子Pax7〔7〕和Pax3〔6〕，肌源调节因子Myf5〔8,9〕，同源盒转录因子Barx2〔10〕，细胞黏连蛋白M-cadherin〔11〕、核纤层蛋白(Lamin A/C)和核骨架蛋白(Emerin)〔12〕、受体酪氨酸激酶c-Met〔13〕、NCAM〔14〕、细胞表面附着受体a7-Intergin〔12，15〕、CD34〔9〕、跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Syndecan)-3和 Syndecan-4〔14，16〕，趋化因子受体CXCR4〔17〕等，但其中最典型且应用最广泛的标志物还是Pax7。

根据不同的基因表达模式，可以将卫星细胞子代与其静止祖细胞区分开来〔1，2〕，静止的卫星细胞通常表达Pax7，从卫星细胞被激活到增殖阶段均共表达Pax7和成肌分化蛋白(MyoD)〔7，18〕，当细胞进入分化阶段时，Pax7表达下降，肌原蛋白标志物肌细胞生成素(Myogenin)表达上调。Day等〔19〕于2007年提出了一种基于Nestin基因调控元件驱动的GFP表达的卫星细胞定位、分离和基因表达分析的新方法。巢蛋白-绿色荧光蛋白(Nestin-GFP)转基因小鼠即由Nestin基因的调控元件驱动GFP表达，最初是为了追踪神经干细胞而开发的，但随后的研究发现卫星细胞在所有检测的肌肉群中都有很强的GFP表达。该特性使得卫星细胞在新分离的肌纤维中即可检测到，但Nestin-GFP的表达在卫星细胞激活后下降，在肌原细胞培养后期通过非增殖的Pax7阳性细胞后代重新获得。这种表达模式的动态变化反映了卫星细胞自我更新的周期。

1.3骨骼肌卫星细胞的异质性 研究发现，卫星细胞存在功能异质性，其并非都具有干细胞特征，在卫星细胞库中存在不同的群体，来自不同肌肉的卫星细胞不仅在增殖率、克隆能力、分化程度和速率、自我更新能力等方面表现出异质性，而且在同一肌肉的卫星细胞之间也存在这些差异，且各群体中的卫星细胞均对肌再生能力有一定的影响。Marg等〔20〕在移植研究中发现在骨骼肌卫星细胞群体中，尚存在一种Pax7阴性的人肌源性细胞集落，同样具有很高的肌再生潜力，且对肌源性标志物结蛋白(Desmin)和Myf5呈阳性，将该细胞移植到小鼠体内后，移植的Pax7阴性细胞重新填充了卫星细胞的生态位，并重新表达Pax7。

2 老年个体中肌卫星细胞的特点

老年肌肉是典型的衰老组织，其特征是脂肪组织浸润、组织纤维化、毛细血管扩张减少及慢性炎症的产生。这些变化将导致肌纤维的大小和数量逐渐减少，被认为是肌肉质量、横截面积和力量逐渐减少的主要原因，这种现象被称为肌肉减少症〔3〕。

卫星细胞对骨骼肌的稳态和再生是至关重要的，在衰老过程中，骨骼肌逐渐减少，肌力和耐力下降，甚至发生肌肉萎缩，这些现象均与卫星细胞数量有一定关系，Fry等〔21〕利用Pax7CreER-DTA 转基因模型小鼠模拟骨骼肌卫星细胞耗尽的状态，证实在卫星细胞减少情况下，确实会对肌再生能力产生影响，但不会加速或加剧肌少症，卫星细胞在衰老过程中对维持肌肉大小或纤维类型组成有一定作用，且细胞外基质的增加表明随年龄增长，卫星细胞的丢失可能导致纤维化。

3 导致衰老机体骨骼肌卫星细胞变化的因素

老年骨骼肌再生功能的下降与卫星细胞功能的改变密切相关。从数量上看，老年个体骨骼肌中卫星细胞池数量明显下降，从功能上看，来源于老年供体的肌卫星细胞增殖、分化形成成熟肌纤维的能力存在显著缺陷，与年轻个体相比，老年个体卫星细胞会延迟进入活化期，且活化标志物明显减少。肌卫星细胞的分化能力也随年龄增长有明显下降。老年机体的肌卫星细胞融合指数下降，限制了肌管融合形成肌纤维的过程，且在老化过程中，肌卫星细胞的异质性也在增加。

3.1宿主微环境对卫星细胞的影响 肌卫星细胞外环境包括肌纤维外多种类型的细胞和细胞外基质，通过分泌营养因子、细胞因子及细胞间相互作用影响肌肉再生。在衰老过程中细胞外环境改变可影响卫星细胞的功能及增殖分化能力，已有实验通过将衰老的细胞移植至年轻的环境，使细胞的增殖分化能力得到恢复。Zhou等〔22〕通过从年轻供体大鼠肌肉前体细胞(YMPCs)和成年供体大鼠肌肉前体细胞(AMPCs)中提取荧光标记的MPCs分别移植到年轻、成年和老年大鼠的胫骨前肌中，从而研究年龄对移植后MPC存活、分化和组织再生的差异影响，结果表明，YMPCs在成熟肌纤维中的整合和成熟取决于宿主微环境的年龄；而AMPCs的整合和成熟较少依赖于年龄，更多依赖于细胞的内在变化。这些数据表明，宿主微环境和移植细胞的年龄在细胞治疗中至关重要。

3.2线粒体功能受损对卫星细胞的影响 随着年龄的增长，骨骼肌中线粒体活性氧的产生增加，导致与年龄相关的肌肉质量和功能的丧失。对大鼠和非人灵长类动物的研究表明，线粒体DNA (mtDNA)的突变和缺失在老化的骨骼肌纤维中明显增加，而这些突变在肌少症易感者的肌肉中更为常见，在骨骼肌中，线粒体DNA缺失突变可能是肌肉萎缩和功能活动下降的一种机制。Wang等〔23〕利用一种线粒体DNA双链断裂(DSBs)转基因小鼠模型，研究了线粒体DNA损伤在肌肉萎缩中的作用，发现线粒体DNA短暂的、系统的双链断裂将导致小鼠晚年肌肉萎缩，运动能力下降，且随着年龄的增长，卫星细胞数量明显减少，肌肉再生及修复的能力都明显下降。因此，系统性线粒体功能受损可能会优先影响卫星细胞库，从而导致肌肉质量下降，最终导致肌少症的发生。

3.3免疫系统对卫星细胞的影响 免疫系统的衰老通过多种机制对肌肉衰老和肌少症起着重要的调节作用，包括对卫星细胞增殖和表型转换的调节，尤其是巨噬细胞，在调节肌肉生长和再生方面具有重要作用。此外，在衰老过程中，免疫系统的功能也会发生变化，这表明在衰老过程中，肌肉细胞和免疫系统之间的调节相互作用也会发生变化，且免疫系统的老化足以引起卫星细胞数量的减少，并使卫星细胞向纤维形成表型转变。

慢性炎症因子被认为是衰老和老年性疾病的潜在机制，可能是正常衰老和老年性病理过程之间的桥梁〔24〕，与年龄相关的细胞内氧化还原平衡的破坏似乎是导致慢性低度炎症的主要原因。在老年人中，炎性细胞因子升高，可能会抑制卫星细胞的分化，从而导致肌肉质量下降，肌肉力量缓慢而渐进的丧失，随后导致肌少症。

有数据表明，在衰老过程中促炎因子〔如肿瘤坏死因子(TNF)-a、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、环氧化酶(COX)-2、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)〕将持续上调，因为年龄相关的氧化还原失衡激活了许多促炎信号通路，包括核因子(NF)-κB信号通路。在老年骨骼肌的氧化应激和慢性炎症过程中，一些主要的信号通路被激活或失活。这些途径与蛋白质合成分解失衡、线粒体功能障碍及细胞凋亡有关，将导致纤维萎缩和纤维损失〔25〕。

Wang等〔26〕在一组实验中将年龄不匹配的供体和受体小鼠进行骨髓移植，以测试免疫系统年龄对肌肉老化的影响，他们将年轻的骨髓细胞移植到年老的受者体内，则肌肉纤维表型改变的情况得以改善。将老的骨髓细胞移植到年轻的动物体内，卫星细胞的数量有所减少，卫星细胞向纤维形成表型转变，证明年轻骨髓细胞释放的因子在体外更有利于肌管的分化。

3.4Notch信号通路对卫星细胞的影响 Notch信号通路是大多数多细胞生物中高度保守的细胞信号系统〔27〕。Notch信号在胚胎和成体发育过程中，对增殖、干细胞维持和分化等许多基本细胞过程的调控中起着关键作用。Notch信号通路包含Notchl、Notch2、Notch3、Notch4四种受体和Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4、Jagged1、Jagged2五种配体〔26〕。

Carey等〔28〕在实验中发现与年轻男性(18～25岁) 相比，老年男性(60～75岁) 肌肉活检中Notch1、Jagged1、Numb和Delta-like1的表达明显降低，这表明Notch可调节因年龄增长而受损的肌肉质量。

Aoyama等〔29〕对受伤肌肉进行分析，结果显示，随着年龄的增长，卫星细胞祖细胞的增殖和产生肌再生所需的成肌细胞的能力明显减弱，是由于Delta上调信号不足，导致对Notch1的激活信号减弱，从而丧失骨骼肌再生潜能，因此，Notch信号是肌肉再生潜能随年龄下降的决定因素。Notch信号通过与Syndecan3协同调控卫星细胞的静息和增殖，并通过与Wnt/β-catenin信号影响细胞的不对称分裂，从而发挥关键作用〔28〕。

3.5Wnt信号通路对卫星细胞的影响 Wnt 信号通路是一种古老的、进化上保守的通路〔30〕，研究发现在许多物种的胚胎发生过程中，Wnt 信号通路可以调节细胞增殖、命运和运动〔31〕。

Dhoot等〔32〕曾在实验中证明衰老肌肉中QSulf1酶可以激活Wnt信号通路，从而调节肌肉的发育和再生。Patel等〔33〕使用Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt4、Wnt6和Wnt7a配体的抗体对28月龄的腓肠肌和6月龄的腓肠肌Wnt信号的激活进行比较，实验结果表明这些配体水平在28月龄的老年肌肉中均有升高，Wnt配体均被激活。

Brack等〔34〕在研究中发现老年小鼠的肌肉干细胞(卫星细胞)在开始增殖时，倾向于从肌原性向纤维原性转变，而这种转变被证实与衰老肌原细胞中典型Wnt信号通路的激活有关，并且可以被Wnt抑制剂抑制，由此判断Wnt信号通路在肌肉干细胞的衰老和伴随衰老的组织纤维化的增加方面发挥关键作用〔35〕。

4 延缓肌卫星细胞衰老、改善衰老肌肉功能手段的研究

目前，肌卫星细胞抗衰老的研究主要集中在：骨骼肌卫星细胞的移植、间充质干细胞的移植、诱导多能干细胞的干预及抗衰老药物和抗衰老因子的干预和治疗等。

4.1干细胞的干预和治疗

4.1.1骨骼肌卫星细胞 Ishii等〔36〕在研究中发现骨骼肌卫星细胞可以在静止或激活状态下被分离出来，在移植到宿主体内后，这些细胞将重新填充卫星细胞的生态位，参与未来的再生过程，实现自我更新。卫星细胞在修复肌肉方面非常有效，单个纤维上的一小部分移植的卫星细胞，甚至是通过荧光激活细胞分选得到的单个卫星细胞，都可以产生几千个肌核。 Feige等〔37〕已建立起一套可靠的方案用于肌肉干细胞的分离及移植，并有效测定干预对体内肌肉干细胞增殖或分化的直接影响，该方法已被用于研究肌肉干细胞群的异质性和治疗干预对分离干细胞群的疗效〔38〕。Hall等〔39〕证明与肌肉纤维相关的卫星细胞的移植，加上诱发的肌肉损伤，显著改变了年轻的成年宿主肌肉的环境，导致肌肉质量、干细胞数量和力的产生几乎终身增强。

4.1.2MDSCs 在骨骼肌的损伤、修复和维持中起重要作用的单能干细胞除了卫星细胞外还有具有多向分化潜能的MDSCs，可分化成为成纤维细胞或腱细胞，在肌腱连接和肌肉相关肌腱损伤的修复中起着重要作用，因而MDSCs移植对肌损伤的修复具有很大的潜力。Parker等〔40〕通过在细胞培养板中包被Delta-1ext-IgG，以激活Notch信号通路以避免由于体外培养引起的细胞移植潜能降低的方式，建立了一套体外扩增MDSCs的方法，并获得了足够数量的细胞进行有效地肌肉移植，最终使移植的纤维数量显著增加，提高了成肌细胞的移植水平，促进肌肉再生。

4.1.3间充质干细胞 非肌原性来源的细胞对肌肉再生同样有益，来自骨髓或脂肪组织的间充质基质细胞可以通过旁分泌信号或免疫调节来刺激再生〔40〕。Maeda等〔41〕给肌营养不良小鼠移植骨髓间充质干细胞，从骨髓间充质干细胞移植小鼠中分离出的单个肌纤维与非移植小鼠的肌纤维相比，肌纤维分裂明显减少，说明移植显著改善了异常再生，且移植模型小鼠较非移植模型小鼠卫星细胞数量有明显增加，证明骨髓间充质干细胞对小鼠肌肉再生有促进作用。Wang等〔42〕的实验中为老年雄性C57BL/6J小鼠移植人脐带沃顿胶间充质干细胞，之后通过对小鼠全身肌力、耐力、腓肠肌质量、肌肉横截面积及炎症因子等多方面比较，证实移植间充质干细胞后，机体内骨骼肌卫星细胞被激活，减少细胞凋亡的比例及骨骼肌慢性炎症的发生〔43〕。

4.1.4诱导多能干细胞(iPSCs) 诱导iPSCs技术可以使成年体细胞重新编程，并使其随后向肌源性谱系发展，因而有学者尝试研究利用iPSCs诱导的肌原性祖细胞进行细胞移植进行相关疾病治疗的可能性〔44〕。Pax3/Pax7在分化PSCs中的条件表达使肌源性祖细胞的再生能力增强，且实验证明体外生成的iPSCs(衍生的肌源性祖细胞)中具有类似于胚胎肌母细胞的分子特征。然而，与胎儿成肌细胞相比，移植后其表现出更好的肌纤维植入和种子卫星细胞生态位的能力，Pax3/pax7诱导的肌源性前体细胞iMPCs移植到成年肌肉环境后，其分子特征发生改变，功能成熟。

Rao等〔45〕通过在从hPSCs分化的近轴中胚层细胞中瞬时过表达Pax7来获得诱导的iMPCs，且在优化的三维培养条件下，来自多个hPSC系的iMPCs可再生地形成功能骨骼肌组织，其中包含排列整齐的多核肌管，当移植到免疫缺陷小鼠的后肢肌肉时，骨骼肌组织逐渐血管化并维持功能〔42〕。

4.2抗衰老药物及其他干预和治疗

4.2.1Sirt1的干预作用 Sirt1是一种NAD+依赖的去乙酰化酶，与长寿有关，具有抗衰老的作用。骨骼肌修复依赖于卫星细胞，卫星细胞功能随年龄增长而减弱，Sirt1过表达会增加老年小鼠肌肉修复和肌肉功能〔45〕。且有研究认为Sirt1是骨骼肌基因表达的重要代谢调节因子〔46〕，当Sirt1活性升高则可以促进卫星细胞的增殖。

Myers等〔46〕在实验中证实敲除卫星细胞Sirt1基因的小鼠，其腓肠肌和比目鱼肌虽然没有明显缩小，但其足底弯曲力明显下降，且肌肉功能也受到了影响。由此证明，卫星细胞中Sirt1的表达对骨骼肌功能发育和肌再生都具有重要意义〔47〕。

4.2.2白藜芦醇的干预治疗 白藜芦醇是一种主要存在于葡萄中的多酚化合物。据报道，白藜芦醇具有抗氧化，延长生命及能量代谢调节作用〔48〕。研究发现，白藜芦醇可以通过激活Sirt1，进而调节其下游因子的表达与活性，发挥抗氧化、抗炎症与抑凋亡等作用。Danz等〔49〕研究发现白藜芦醇通过改变线粒体功能，激活 Sirt1通路来防止氧化应激。另外，白藜芦醇通过增强 Sirt1表达进而增加胰岛素抵抗大鼠原代脂肪细胞的葡萄糖消耗和超氧化物歧化酶(SOD)含量，抑制丙二醛(MDA)的产生。

白藜芦醇作为Sirt1的激活剂，被证实在老年大鼠后肢悬吊后恢复期使用可对后肢肌肉的卫星细胞增殖有改善作用〔50〕，白藜芦醇可以降低ROS水平，防止激活的卫星细胞在压力下数量和功能丧失，对静止的卫星细胞也有一定影响。

4.2.3Senolytics类药物的药物干预治疗 随着年龄的增长，许多组织、慢性疾病相关的器官中衰老细胞会逐渐增多，且衰老细胞会持续存在，因为它们会分泌许多促炎和组织重塑分子，所以会对周围细胞产生毒性。通过转录分析，研究人员发现，与癌细胞一样，衰老细胞增加了“促生存网络”的表达，从而帮助其抵抗细胞凋亡或程序性细胞死亡。

Senolytics是一类选择性杀伤衰老细胞的药物，直到现在，已报道的Senolytics药物有7类，包括激酶抑制剂、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2家族抑制剂，天然化合物，p53结合抑制剂，HSP90抑制剂，UBX0101，和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。最近，达沙替尼和槲皮素的联合应用的研究被报道，研究表明达沙替尼和槲皮素能够选择性地诱导衰老细胞死亡〔35，51〕。其中，达沙替尼可清除衰老的人脂肪细胞祖细胞，而槲皮素对衰老的人内皮细胞和小鼠骨髓干细胞的杀伤作用更强〔35〕。当两种化合物联合使用时，清除衰老细胞的功效是最强的，可增强老龄小鼠的生理功能，延长健康寿命和寿命。

5 面临的问题及未来研究方向

衰老期肌卫星细胞的增殖分化受到多种因素调控，细胞因子和信号通路的作用、氧化应激和骨骼肌分子炎症的作用将有利于加深对骨骼肌衰老的认识，帮助我们更好地了解肌少症的病因和进展，为临床运用提供理论基础，为老年或老年病造成的肌少症等疾病提供新的治疗思路〔52，53〕。如将细胞因子和干细胞移植相结合，两种方式同时进行干预，改变老年肌源性祖细胞的生长环境，将有效促进骨骼肌再生，使肌少症患者的临床症状得到有效缓解。

由于肌少症病因复杂，寻找真正有效可行的治疗策略可能还需要结合多学科，进行更深入的研究。目前国内外已开展多项干细胞治疗，通过干细胞的植入，促进肌肉损伤修复和再生，改善潜在的肌肉骨骼疾病〔54，55〕。干细胞的移植效率及移植后骨骼肌再生能力的改善则成为治疗后需要关注的重要问题。以细胞为基础的治疗肌肉再生障碍的最佳疗法应该是提供一个静止的卫星细胞池，以确保维持和再生〔18，56〕。

综上，通过大量研究证实，随着年龄增长，骨骼肌逐渐减少，肌力和耐力下降等症状均与卫星细胞数量有关系，且受机体微环境等因素所影响，衰老相关的肌卫星细胞的研究已经很多，也趋于成熟，取得了一定积极的成果，但如将这些方法应用于临床则仍有很大改善空间，研究人员仍需寻找有产肌能力的替代细胞或药物方面进行深入的探索研究，从而使患者得到更好的诊断和治疗。