活性氧介导椎间盘髓核细胞焦亡调控炎症反应

付豪永 王月田 孙浩林 (北京大学第一医院骨科,北京 100034)

终板炎(Modic)改变是老年人下腰痛(LBP)最重要的原因之一。LBP 导致全球疾病劳力丧失,成为世界范围内主要健康负担〔1,2〕。LBP 发病因素复杂多样,但其主要为多因素共同作用的结果。既往研究发现,腰椎间盘退行性变是LBP 发生的原因之一〔3,4〕。但是目前越来越多的研究发现,Modic 也能够引起LBP 改变,而且是中重度LBP 的主要原因之一。Modic 改变椎间盘中存在高水平的活性氧(ROS),它与许多年龄相关疾病的发病机制有关,包括椎间盘疾病(IVDD)。髓核细胞中,氧化应激抑制细胞增殖,诱导过早衰老,并促进基质分解代谢加重退变。所以,ROS 可能作为Modic 改变发生发展的关键刺激因素。焦亡是炎性细胞死亡的过程,能够诱导强烈的炎症反应,使细胞肿胀,细胞破裂和促炎因子释放,保护宿主免受病原微生物感染〔5〕。然而,焦亡过度激活会导致炎症性疾病,如脓毒症和自身免疫性疾病。在外界刺激存在时,经典途径对病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMP)作出反应〔6,7〕。然后,外界刺激会促使模式识别受体(PRR)招募凋亡相关斑点蛋白,其含有CARD C 端招募域(ASC)的接头蛋白并激活效应器半胱氨酸天冬氨酸前体(pro-caspase)-1,形成炎症小体复合物。随着pro-caspase-1 成熟为Caspase-1,引起GSDMD-N 末端的暴露形成细胞膜孔,使细胞内合成的白细胞介素(IL)-1β 和IL-18 炎症因子通过细胞膜孔释放至细胞外,引起炎症反应的发生〔8,9〕。鉴于焦亡在下腰痛伴Modic 改变椎间盘中存在以下几个问题:尚无确切报道;Modic 改变中高ROS 水平是否会引起炎症反应和焦亡,三者之间的关系如何。因此,本文将验证髓核细胞内ROS、焦亡、炎症之间的关系。

1 材料与方法

1.1 髓核组织标本收集及纳入、排出标准 纳入的髓核组织样本来源于北京大学第一医院住院患者,均来自本课题组经椎间孔镜(PELD)队列。在研究开展前,每名捐赠髓核组织的患者均签署知情同意书, 并且本研究已通过伦理委员会审批(No.2020417)。纳入标准:①根据术前影像学资料,诊断为腰椎间盘突出症,腰椎管狭窄症,退变性腰椎滑脱症,腰椎退变性侧弯且Pfirrmann 分级Ⅲ～Ⅴ级,磁共振影像显示伴有(Modic 组13 例)或不伴有Modic 改变的患者(对照组14 例);②年龄40～70 岁,性别不限。排除标准:①合并肿瘤疾病,传染病,如脊柱结核感染等;②拒绝参加本研究;③既往有脊柱手术病史。对照组男8 例,女6 例,平均年龄(55.26±7.39)岁;Modic 组男8 例,女5 例,平均年龄(58.40±8.02)岁。两组性别、年龄基线资料无显著差异(P＞0.05)。

1.2 髓核组织免疫组化染色 通过免疫组化染色法检测Modic 组,对照组椎间盘内ASC 蛋白表达差异,方法如下:分离髓核组织:手术室所取标本在超净台中用磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗,洗尽血渍。加入4%多聚甲醛覆盖整个髓核组织,4℃过夜。切片机将蜡块切割为5 μm 的薄片,用温水使其平整,覆盖于玻璃片上,用烤箱烘干备用。系列处理后,封片后观察结果。

1.3 Modic 髓核检测ROS 将对数期髓核细胞1×105接种至共聚焦培养皿中,加入8% FBS/F12 培养基,放入孵箱中培养。待髓核细胞贴壁后,加入2 ml DCFH-DA 工作液,37℃孵箱孵育30 min。加入2 ml Hochest33258 染液,37℃孵箱继续孵育30 min。上机进行荧光检测。

1.4 大鼠髓核细胞的提取 酒精喷布大鼠尾部消毒,获取整根大鼠尾部。用手术刀在大鼠尾部皮肤纵向切开,借助纱布沿切口剥离大鼠尾部皮肤,两手持椎间盘两侧椎体,用力向不同方向挤压针刺的破口椎间盘,将白色凝胶状髓核挤出。并加入2% Ⅱ型胶原酶1.5 h 后,完全培养基终止消化,得到单细胞悬液,进行髓核细胞培养。

1.5 髓核细胞乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞活力在96 孔板内接种1×104个/孔,共100 μl,在孵箱内37℃,5% CO2培养24 h 贴壁。吸除培养基,加入不同浓度H2O2100 μl 在孵箱内孵育3 h。每孔加入10 μl LDH 液。细胞孵箱内继续孵育2 h。取出96 孔板,用酶标仪检测吸光值。

1.6 扫描电镜观察髓核细胞膜结构 利用不同浓度H2O2处理10 cm 皿P3 代髓核细胞,后将0.05%胰酶加入至培养皿中,将细胞消化为细胞悬液,1 000 r/min离心5 min,弃上清液。吸取1 ml 戊二醛固定液,沿离心管壁轻轻滴加覆盖样品,固定过夜。使用不同浓度的乙醇使样品脱水,在CO2临界点烘干机中干燥。用双面导电胶带把样品黏附于上样台中,离子溅射后通过电子显微镜观察拍照。

1.7 免疫荧光检测髓核细胞氧化应激模型Hochest33258/PI 双染 加入2 ml Hochest33258,37℃,5% CO2孵箱培养30 min。用535 nm 激发波长,615 nm 发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。

1.8 生物信息学分析胞外刺激对髓核细胞表观遗传学影响 在Pubmed 网站检索GSE42611 数据集,将数据集内两组不同处理方式的细胞样品进行分组,进入G2R 分析差异基因。将获得的差异基因整理为Excel 形式,按照FDR-校正P＜0.01 并且差异倍数(FC)＜-1 或＞1 对差异基因进一步筛选,进行基因本体论数据库(GO)与京都基因和基因组百科全书(KEGG)的分析。GO 富集分析,涵盖生物学三大层次,如细胞组分(CC),分子功能(MF),生物过程(BP)。KEGG 分析,涵盖细胞生化过程,如代谢、膜转运、信号传递、酶反应等,将差异基因与生物在线基因组数据库内基因集进行比对。

1.9 Western 印迹 从4℃冰箱中取出预制胶,用电泳液清洗干净,将玻璃板安装至电泳槽内,加入预制胶电泳液,使其充满于两板之间。各泳道依次加入样品蛋白及蛋白预染液。取相应长宽的聚偏氟乙烯(PVDF)膜,并将其放入甲醇中活化1 min,取出放入电转液中30 min。

1.10 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测髓核细胞氧化应激模型IL-18 合成与分泌 过氧化氢母液10 mmol/L 成不同浓度的 H2O2。每孔按照1×105个/ml接种至96 孔板,加入不同浓度H2O2处理3 h。检测不同浓度过氧化氢刺激髓核细胞后合成和分泌IL-18 的情况,具体步骤同说明书。

1.11 统计学方法 采用SPSS19.0 软件进行t检验或单因素方差分析,GraphPad Prism9.0 绘制图片。

2 结 果

2.1 两组术前腰椎功能及疼痛程度视觉模拟评分(VAS) 术前磁共振影像学见图1。Modic 组腰部VAS〔(5.60±2.66)分〕显著高于对照组〔(3.50±2.25)分,P＜0.05〕。

图1 Modic 组不同核磁加权象

2.2 Modic 改变椎间盘标本HE 染色病理学观察相比对照组,Modic 组切片组织完整性较差,髓核细胞核涨大,细胞质内容物含量较多,有明显的形态学改变,提示Modic 改变髓核细胞的通透性可能发生改变。见图2。

图2 Modic 改变椎间盘标本(HE 染色,×10)

2.3 Modic 改变临床组织标本焦亡的Western 印迹和实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测 依据经典Modic 改变影像学诊断指标和Pfirrmann 分类标准,纳入分级为Ⅳ级伴或不伴Modic 改变组织进行髓核组织切片,行免疫组化ASC、CD3+、CD8+蛋白染色如图3 所示,箭头表示两组各蛋白染色的阳性细胞,Modic 组炎症和焦亡相关蛋白均高于对照组。与对照组比较,Modic 组焦亡相关ASC 蛋白含量较高,炎症相关蛋白CD3+,CD8+显著升高。Modic 组髓核组织中NLRP3 表达量(0.72±0.14)较对照组(0.36±0.14)明显增加(P＜0.05)。见图4。用10 例患者行生物学重复,qPCR 检测发现与对照组(1.00±0.00、1.00±0.00)比较,ASC(7.52±3.21)、IL-1β mRNA 表达量(1.98±0.26)在Modic 组显著增加(P＜0.05)。

图3 两组焦亡相关蛋白(免疫组化染色,×10)

图4 Western 印迹检测两组NLRP3 蛋白表达

2.4 Modic 改变临床标本ROS 含量 与对照组相比,Modic 组免疫荧光显示细胞内ROS 水平更高。见图5。因此,在Modic 改变中可能存在调节ROS水平并起到平衡作用机制的功能基因或通路。

图5 免疫荧光比较不同组间ROS 水平(×100)

2.5 处理后细胞活力检测和胞外LDH 释放检测3 次平行试验检测胞外LDH 释放发现,当H2O2浓度在400 μmol/L(吸光值0.16±0.27)和500 μmol/L(吸光值0.5 ± 0.15)时,相较于0 μmol/L(吸光值-0.17±0.16),细胞膜完整性受到严重破坏,大量LDH 从细胞内释放,差异具有统计学意义(P＜0.05)。100、200、300 μmol/L H2O2处理后LDH 释放吸光值分别为-0.10±0.12、0.11±0.08、-0.03±0.25。

2.6 髓核细胞焦亡形态学特征 0、400、500 μmol/L浓度H2O2处理髓核细胞3 h,扫描电镜观察发现,0 μmol/L处理的髓核细胞,细胞膜完整,而400、500 μmol/L 处理的细胞膜出现较多孔隙,同时细胞膜周围出现大量空泡。见图6。

图6 倒置显微镜扫描电镜观察不同浓度H2O2 处理髓核细胞3 h 焦亡形态

2.7 氧化应激模型髓核细胞PI 阳性率检测 当400 μmol/L 及以上H2O2处理时髓核细胞PI 染色阳性细胞增多。见图7。

图7 髓核氧化应激模型免疫荧光检测PI 阳性细胞(×100)

2.8 生物信息学分析胞外刺激对髓核细胞表观遗传学影响 GO 条目明显富集于“对氧水平反应”,“细胞因子调节”“IL-1 反应”“正向调控细胞死亡”,受到胞外刺激与髓核细胞活性氧水平显著相关。同时,髓核细胞与IL-1 及细胞内其他炎症因子产生也存在显著功能富集。胞外刺激对髓核细胞本身发生凋亡、铁死亡等细胞死亡显著富集。KEGG 通路明显富集于“PI3K-AKT 信号通路”“TNF 信号通路”“NOD 样受体信号通路”“细胞因子受体相互作用”相关通路。其中PI3K-AKT 能够调节细胞增殖、分化、凋亡等细胞表型。TNF、NOD 样受体通路与细胞的炎症等表型相关。见图8。

图8 生物信息学GEO 数据库分析胞外刺激对髓核细胞表观遗传学影响

2.9 ELISA 检测氧化应激模型IL-18 水平改变 氧化应激后髓核细胞释放至胞外的IL-18 水平在300、500 μmol/L H2O2刺激时显著升高(P＜0.05,P＜0.001);实验结果表示氧化应激后髓核细胞内合成的IL-18 水平在300、400、500 μmol/L H2O2刺激时显著升高(P＜0.05,P＜0.001)。见表1。

表1 ELISA 检测不同浓度H2O2 刺激时髓核细胞氧化应激炎症因子改变(±s,pg/ml,n=3)

表1 ELISA 检测不同浓度H2O2 刺激时髓核细胞氧化应激炎症因子改变(±s,pg/ml,n=3)

与0 μmol/L H2O2 比较:1)P＜0.05,2)P＜0.001

指标0 μmol/L300 μmol/L400 μmol/L500 μ mol/L IL-18 合成23.96±1.7628.01±2.181)32.43±0.972)34.41±0.162)IL-18 释放30.18±3.1333.87±1.281)32.97±0.5444.41±2.722)

3 讨 论

下腰痛作为世界上最严重的致残性疾病之一,会对老年人造成严重的不良后果,不仅增加医疗负担也使患者损失工作能力〔10〕。有研究报道LBP 的发病因素复杂多样,其中椎间盘发生Modic 改变是一个重要因素〔11,12〕。通过研究,发现Modic 改变中存在氧化应激状态。同时,根据既往研究报道,亚细胞毒性浓度的H2O2可以增加细胞内ROS 水平,激活应激相关通路。同时,退变椎间盘中羧甲基赖氨酸的存在表明氧化应激也可能是导致椎间盘退变的一个因素。因此基于研究结果和现有文献报道,做出假设ROS 可能是存在于Modic 改变椎间盘内刺激因素之一。基于Modic 改变髓核细胞内高ROS水平,炎症相关蛋白高表达,认为Modic 改变患者下腰痛可能与炎症相关。为了进一步验证ROS 水平升高与髓核细胞发生炎症反应和焦亡的关系,本研究利用H2O2刺激椎间盘髓核细胞,以构建高ROS水平的氧化应激细胞模型。通过免疫荧光检测不同浓度H2O2处理后,髓核细胞内ROS 水平,发现400 μmol/L,500 μmol/L 均能过有效提高细胞内活性氧水平,且细胞活力有保证。根据既往研究报道焦亡有三大特征〔13〕,如细胞膜孔形成、细胞胀大溶解和细胞内容物释放。本研究利用扫描电镜对细胞膜进一步深入观察,发现处理后的髓核细胞比对照组有更多的“膜孔”,膜孔的增加为椎间盘髓核细胞焦亡的发生提供有力证据。

为定量准确的验证处理后的椎间盘髓核细胞的细胞膜完整性发生损害,本研究检测了LDH 的细胞外释放量。细胞生物学中可知,细胞膜结构的破坏会导致细胞质内的酶释放到培养液里,其中包括酶活性较为稳定的LDH,通过检测从质膜破裂细胞中释放到培养液中的LDH 的活性,就可以定性的反应细胞膜完整性,是膜完整性的重要指标〔14〕。

为了得到生物信息学方面的多层次认证,本研究通过挖掘GEO 发现,类似于胞外ROS 刺激的其他外界刺激如TNF-α 和IL-1β 对椎间盘髓核细胞干预,显著富集椎间盘髓核细胞内活性氧水平条目和炎症因子产生等条目,而炎症因子的产生是焦亡的一大特征〔15〕。最重要的是,该基因集明显富集于多种调控性细胞死亡如凋亡、焦亡、铁死亡等,为本研究在生物信息学层面提供支持。综上,椎间盘髓核细胞内ROS 水平升高,会导致髓核细胞焦亡和炎症状态的发生。