多黏菌素B对大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型损伤的影响及机制

龙似维 刘强 (锦州医科大学 1 研究生院,辽宁 锦州 11000; 附属第三医院神经内科)

2019年10月29日是“世界卒中日”,而脑卒中也被权威期刊《柳叶刀》列为中国三大致死性疾病第二位,与此同时还具有颇高的致残率〔1〕。根据统计数据,在国内每12 s 就有人面临这种疾病的考验〔2〕。以往大量研究显示〔3〕,在机体各种应激状态下,如脑缺血-再灌注(IR)损伤时,全身炎症反应剧烈,同时可伴有肠道黏膜屏障功能障碍,肠道菌群移位,肠菌有害代谢产物入血,加重免疫反应及脑损伤。本研究通过制备大脑中动脉缺血-再灌注模型(MCAO/R),检测大鼠脑IR 损伤后异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FD)4、脂多糖(LPS)浓度变化,证实该模型肠道黏膜屏障破坏,通透性增加,并以此为基点,使用对多种阴性菌有抑制作用的抗生素多糖菌素(PM)B 进行处理,通过观察各种指标的变化,评价PMB 处理后大鼠脑IR 损伤的炎症反应情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选取由锦州医科大学实验动物中心提供,许可证号为SCXK(辽)2017-0004 的健康雄性10 周龄清洁级SD 大鼠共120 只,体重250～320 g;术前严格禁食12 h,不禁水。动物实验获得锦州医科大学动物伦理委员会批准。死亡动物按上述要求、随机原则进行补齐数量。按照随机原则分为3 组:假手术组、MCAO/R 组、PMB 组,每组40 只。MCAO/R 组和 PMB 组大鼠制作右侧MCAO/R 模型;假手术组分离颈部血管,并结扎前述相应血管,除线栓不插入血管外,其他步骤与另两组相同。上述造模过程成功后立即按照2.5 μg/g浓度进行腹腔内注射,假手术组和MCAO/R 组注射生理盐水,PMB 组注射PMB 溶液。

1.2 造模 参照辛世萌等〔4〕的方法制备线栓,采用改良的Longa 线栓法〔5〕,制备该模型。称重后的大鼠使用10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉。仰卧位固定,分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。在CCA 远心端、近心端及ECA 挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA,然后近心端结扎CCA、ECA。在距CCA 分叉部4 mm 处剪一小口,将栓线插入到ICA,这时用绕在CCA 远心端的细线轻轻系牢栓线,用眼科镊轻推栓线,从血管分叉处开始算距离,当插入深度在18 mm 时(将血管放松至原来状态,且保证标记点在分叉处),紧紧系牢CCA 远心端的细线。术后采用Longa 5 分法对模型大鼠神经行为学进行快速评价,评分＞1 分即可从神经缺损评分角度认为模型制备成功(0 分:正常;1 分:瘫痪侧前爪不能完全伸展;2 分:行走时,大鼠向瘫痪侧转圈;3 分:行走时,大鼠身体向瘫痪侧倾倒;4 分:不能自发性走,有意识丧失)。成功后暂时缝和皮肤。缺血2 h 后再次麻醉小鼠,从右侧ECA 拔出线栓并将其近心端结扎,造成大脑中动脉(MCA)再灌注,缝合皮肤。

1.3 检测时间节点及项目 各组大鼠在IR 后24 h后,分别使用Bederson 神经功能缺损评分表进行神经行为学评分,荧光分光光度法测量外周血FD4 浓度,鲎试剂终点显色法测量外周血LPS 浓度,干湿比重测量脑组织含水量,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠右侧海马CA1 区组织病理学表现,反转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)测量大鼠右侧海马CA1区白细胞介素(IL)-1β mRNA 的表达。

1.4 神经行为学Bederson 评分 0 分:无明显神经功能缺损表现;1 分:不能伸展患侧前肢;2 分:患侧对外力抵抗能力下降;3 分:提尾时向患侧转圈;4 分:自动转圈;5 分:无自发性活动、意识障碍。

1.5 荧光分光光度法测量外周血FD4 浓度 每组取10 只大鼠;给予FD4(剂量为0.4 mg/g)灌胃;3 h后10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉;下颌静脉丛取血入EP 管〔乙二胺四乙酸(EDTA)处理〕,标记,摇匀放入4℃冰箱备用(如立即使用可暂放冰上);荧光分光光度计波长为488 nm 检测;使用标准曲线计算样品FD4 浓度(ng/ml)。

1.6 鳌试剂终点显色法测量外周血LPS 测定 厦门鳌试剂有限公司64T 显色试剂盒(按照说明进行操作);准备样品;配制LPS 标准溶液(注意需要在4 h内使用完,标准曲线的溶液浓度为0.100、0.050、0.025、0.010、0.000 EU/ml);BET 水作为阴性对照;光谱仪设定读板波长405 nm(生物光模式);配制鲎试剂和显色基质;检测样品检测,读取吸光度值;通过标准品及吸光度值拟合建议标准曲线,计算样品LPS 浓度。

1.7 干湿比重法测量脑组织含水量 每组取5 只大鼠;10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉;断头取脑;分离右侧大脑半球,测湿质量;组织于10℃烘烤24 h 后测干质量;按照公式计算: 脑含水量(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.8 HE 染色法光镜下观察脑组织病理变化 每组取5 只大鼠;10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉;断头取脑;分离右侧大脑半球;进行石蜡切片,常规脱蜡至水洗;苏木素染色后水洗;1% 盐酸酒精分化后水洗至返蓝;1% 伊红酒精复染;常规梯度酒精脱水,透明,封片。

1.9 RT-PCR 检测IL-1β mRNA 表达 每组取5 只大鼠;10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉;断头,无菌条件下,迅速分离右侧大脑半球海马组织,放于盛有液氮的研钵中研成粉末;将粉末以100 mg/管分装于编号后的EP 管中,-70℃冰箱中保存备用;提取TOTAL RNA:按照Trizol Reagent(Invitrogen 公司)说明书操作(注意:使用无菌无酶的吸头;使用一次性塑料手套和口罩进行所有试剂配制和实验操作,以避免RNase 污染。)测定Total RNA 的OD260/280 值及样品浓度:OD 260/280 值在1.8～2.0 之间为宜。1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA:点样-跑胶-紫外灯观察-照相,条带越淡越好。反转录过程:应用TaKaRa 的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(货号RR047A)试剂盒,严格按说明书配制及相关操作(注:反应条件如下:50℃,30 min→99℃,5 min→5℃,5 min→4℃保存)。以β-actin 为内参照,双重PCR 检测IL-1β mRNA 的表达,RT-PCR 扩增产物的电泳检测:点样-电泳1 h-紫外灯观察-扫描-照相;利用图像分析软件Gene Tools 分析灰度比。

1.10 统计学处理 采用SPSS21.0 软件进行方差分析、LSD 法和Pearson 相关性分析。

2 结 果

2.1 PMB 处理后MCAO/R 大鼠神经功能评分改变

假手术组神经功能缺损评分为0 分;与假手术组比较,MCAO/R 组与PMB 组神经功能缺损评分均明显增加,其中MCAO/R 组增加更明显(P＜0.01);与MCAO/R 组相比,PMB 组神经功能缺损评分明显减少(P＜0.01)。3 组间比较有统计学差异(F=197.71,P＜0.01)。见表1。

2.2 MCAO/R 后肠道通透性改变 与假手术组比较,MCAO/R 组与PMB 组血浆FD4 浓度明显升高,且MCAO/R 组升高更明显(P＜0.01);与MCAO/R组相比,PMB 组血浆FD4 浓度明显下降(P＜0.01)。3 组间比较有统计学差异(F=20.37,P＜0.01)。见表1。

2.3 PMB 处理可降低MCAO/R 外周血LPS 浓度与假手术组相比,MCAO/R 组与PMB 组外周血LPS浓度均明显升高,其中以MCAO/R 组升高更明显(P＜0.01);与MCAO/R 组相比,PMB 组外周血LPS浓度明显下降(P＜0.01)。3 组间比较有统计学差异(F=980.56,P＜0.01)。见表1。

2.4 PMB 处理可减轻MCAO/R 脑水肿情况 与假手术组相比,MCAO/R 组与PMB 组脑组织含水量均明显升高,MCAO/R 组升高更明显(P＜0.01);与MCAO/R 组相比,PMB 组脑组织含水量明显降低(P＜0.01)。3 组间比较有统计学差异(F=96.93,P＜0.01)。见表1。

2.5 PMB 降低脑MCAO/R 组织海马CA1 区IL-1β mRNA 表达 假手术组的梗死区IL-1β mRNA 呈低水平表达;与假手术组相比,MCAO/R 组与PMB 组IL-1β mRNA 的表达水平明显升高,MCAO/R 组升高更明显(P＜0.01);与MCAO/R 组相比,PMB 组的梗死区IL-1β mRNA 表达水平明显下降(P＜0.01)。3 组间比较有统计学差异(F=136.69,P＜0.01)。见表1、图1。

表1 各组MCAO/R 大鼠数据比较(±s,n=40)

表1 各组MCAO/R 大鼠数据比较(±s,n=40)

与假手术组比较:1)P＜0.01,与MCAO/R 组比较:2)P＜0.01

组别Bederson 评分(分)脑组织含水量(%)海马CA1 区IL-1β mRNA 表达外周血FD4浓度(μg /ml)外周血LPS浓度(EU/ml)47±0.20 MCAO/R 组3.38±0.931)83.58±1.051)1.43±0.171)10.02±2.861)0.94±0.231)PMB 组2.55±1.011)2)79.70±1.131)2)0.89±0.041)2)4.86±1.321)2)0.55±0.301)2)假手术组0.00±0.0075.98±0.740.48±0.212.48±1.350.

图1 各组脑组织海马CA1 区IL-1β mRNA 表达

2.6 PMB 减轻MCAO/R 后梗死区域组织细胞损伤(光镜结果) 假手术组:右侧海马CA1 区组织形态正常,细胞核大且呈圆形,胞质染色均匀;MCAO/R组:右侧海马CA1 区组织间质疏松、水肿,细胞体积缩小、排列紊乱,核固缩;PMB 组:右侧海马CA1 区神经细胞浓缩和间质肿胀程度明显减轻,排列较规整。见图2。

图2 各组光镜下脑组织变化(HE 染色,×400)

2.7 相关性分析 PMB 组的梗死区脑组织含水量与外周血LPS 浓度存在显著相关性(r=0.945,P=0.01)。

3 讨 论

缺血性脑卒中是中国现今致残、致死率最高的疾患,其总量约占脑卒中的80%,尽管静脉溶栓及血管内治疗这些再通技术的应用明显降低了其死亡率,但组织复流后出现的神经功能障碍加重,尤其是大动脉闭塞、功能区域的再灌注损伤,往往会使血管再通患者死亡,大大减低了临床治疗效〔6〕。

在脑I/R 损伤的所有反应机制中,炎性反应发挥着起始和损伤作用。其中,IL 是非常重要的一类细胞因子,又以在组织器官损伤中也是极为重要的炎症因子IL-1β 研究最多。虽然在正常脑组织中IL-1β 含量较少,但是在CIRI 后,活化的单核细胞、巨噬细胞等合成和分泌IL-1β 量增加,进一步刺激血管内皮细胞产生细胞间黏附分子(ICAM),使中性粒细胞直接黏附于血管内皮,大量聚集的炎性细胞又可以再次诱发过度氧自由基释放、细胞因子过表达,往复循环促发越来越多的中性粒细胞,使炎症反应恶性加重,最终导致了动脉内径变窄甚至闭塞。以上过程通过激活丝裂原活化蛋白酶(MAPK)、核转录因子(NF)-κB、蛋白激酶(PK)C 等信号通路完成。这些信号通路最终导致血脑屏障(BBB)破坏,神经细胞的凋亡,脑组织水肿加重情况〔7〕。

而在实际情况下,肠道菌群的种类及其功能受遗传、年龄、生活习惯、疾病、药物等多种因素影响。其组成具有多样性,一般在出生后的3年内逐渐稳定,并长期保持相对稳态。在机体正常运行中,肠道菌群的这种动态平衡起着至关重要的作用,一旦由于某些原因打破平衡,菌群出现移位,其代谢后产生的有害物质可通过激活免疫系统,促进炎性反应,加重血管壁炎症,促进动脉硬化发生、发展〔8〕。而炎症反应本身也是缺血再灌注损伤的一个重要发生机制,其病理基础以炎性介质失控、释放而形成“瀑布效应”,引起继发神经细胞变性、坏死、凋亡等〔9〕。CIRI 后,产生了氧自由基的过度表达,其可转变成毒性更强大的羟自由基,形成自由基的连锁反应。自由基破坏了内皮细胞膜的结构,使其过氧化,线粒体呼吸链的直接受损,诱发了细胞凋亡的发生。在肠道通过肠脑轴与大脑交流的同时,大脑对肠道菌群也是有影响的。相关研究表明〔10〕,大脑对于肠道功能调节起着极为重要的调节作用,如肠道平滑肌横向及纵向运动、胃肠消化液的产生及分泌、黏膜免疫应答等;特殊情况下,肠道通透性也是可以被大脑所影响的,进而改变了肠道菌群多样性、分布的广度和宽度。在进入老年后,肠道菌群多样性和丰富性将有所下降,这也可能成为老年病、慢性病的病机,这种慢性炎症在动脉粥样硬化中普遍存在。目前有研究发现,这些因素都使患者动脉硬化、血栓事件发生的风险明显增加〔11〕。

临床上PMB 是一种对绿脓杆菌、大肠杆菌、克雷伯杆菌及嗜血杆菌等多种阴性菌有抑制作用的抗生素,而对其他抗生素耐药的菌株对PMB 也是敏感。而实际工作中由于其严重的肾毒性及神经阻滞作用,使应用被限制在烧伤合并败血症且为短期抢救用或外用。静脉注射后极可能出现呼吸衰竭。国内外的多项关于PMB 的研究,多是关于败血症、重症肺炎等的序贯体外疗法〔12〕,国内有学者研究PMB与I/R 损伤,但多在肠道损伤、心肌损伤、急腹症等方面〔13〕,极少数的研究者〔14〕涉及脑组织I/R 损伤,但所研究的为先造成模型肠道菌群失调,再研究I/R损伤后的炎症反应,其机制考虑到肠道通透性改变,并未得到实验证实。本研究通过制造大鼠脑I/R损伤模型,外周血FD4〔15〕浓度测量证明了肠道通透性的变化,又抑制肠道菌群代谢产物LSP 入血,验证了在脑I/R 损伤时可减轻缺血区脑组织损伤,可降低神经功能缺损评分。

本研究结果表明,神经功能缺损评分直接反映了脑组织损伤带来的不良后果,而后通过组织含水量测量、梗死区脑组织病理切片印证了脑损伤的严重程度,而在应用PMB 干预后,相关性分析显示,随着外周血LPS 比例升高,梗死区脑组织含水量有升高,二者呈正相关。所以降低外周血LPS 比例可能成为以后治疗脑梗死、保护缺血半暗带的新靶点。本研究还发现,脑缺血再灌注损伤后,促炎因子IL-1β 在梗死区域异常过度表达,推测肠道菌移位、肠道菌群代谢产物入血,加重了其异常表达,也加重了脑梗死,但还有待于后期进一步深入实验。但以上两个新靶点是否适用于其他组织、器官缺血再灌注损伤还有待于进一步研究确定。

综上,脑I/R 损伤后肠道通透性增加导致血液中内毒素升高,而PMB 可能对肠道黏膜屏障起到保护作用,进而抑制肠道菌群失调,减轻了局部缺血灶的炎性反应,进而减轻脑水肿,降低神经缺损行为学评分。纠正肠道菌群移位、减少其有害代谢产物,也可能成为减轻脑组织缺血再灌注损伤治疗的新靶点。