PD-L1、SULT2B1、CD44和CapG在胃癌组织中表达及临床意义

李早红 刘海芳 (义乌市中心医院病理科,浙江 义乌 322000)

胃癌早期症状较为隐匿,通常确诊时已属中晚期,导致其错失最佳根治时机〔1～4〕。因此,及时有效地诊断和治疗胃癌尤为重要。程序性死亡因子1 及其配体(PD-L1)是机体免疫系统中的一种抑制性通路,近年来发现在多种恶性肿瘤中异常表达〔5〕。胞质磺基转移酶(SULT)2B1 是以羟基类固醇为底物的一种转移酶,在多种肿瘤组织中异常表达〔6〕。近年来研究发现,CD44 和巨噬细胞加帽蛋白(CapG)在多种恶性肿瘤中异常表达,且参与肿瘤侵袭和迁移〔7,8〕。本研究旨在探讨PD-L1、SULT2B1、CD44 和CapG 在胃癌组织中表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取义乌市中心医院2019年9月至2021年9月手术后胃癌组织及癌旁组织73 例,其中男43 例,女30 例;年龄65～81 岁,平均(74.48±6.39)岁;TNM 分期:Ⅰ期8 例,Ⅱ期19 例,Ⅲ期46 例;分化程度:高、中分化38 例,低分化35 例;肿瘤直径:＞5 cm 31 例,≤5 cm 42 例;肿瘤位置:胃窦胃体48 例,贲门胃底25 例;伴远处淋巴结转移(除胃癌周围淋巴转移外,如锁骨、盆腔、腹腔及肝十二指肠韧带等)47 例。纳入标准:①经组织病理学证实为胃腺癌,癌旁组织距胃癌组织3～5 cm;②TNM 分期I～Ⅲ期;③临床资料完整;④签署知情同意书。排除标准:①其他类型胃癌或伴其他恶性肿瘤;②术前行新辅助治疗者;③心、肺、肝、肾功能严重异常者;④合并内分泌系统疾病者;⑤严重精神疾病者。

1.2 主要试剂 二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、兔抗人PD-L1 多克隆抗体、兔抗人SULT2B1 多克隆抗体(上海基因公司DAKO),CD44 抗体(美国Abcam 公司)和CapG 抗体(美国Abcam 公司)。

1.3 PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达测定 采用免疫组化法测定胃癌组织及癌旁组织 PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达:取确诊的原腺癌后的蜡块组织,石蜡切片4 μm,切片采用二甲苯-梯度乙醇脱蜡至水,洗净和修复抗原后,加入过氧化氢阻断过氧化物酶封闭15 min,再以Ultra V Block 封闭背景,洗净后加入PD-L1 抗体(1 ∶200)和SULT2B1 抗体(1 ∶100)孵育过夜,再加入二抗孵育,采用DAB 显色。苏木素复染,脱水,透明,封片,镜下观察。所有结果由同一专业资深的病理主任医师完成评价。结果判定:PD-L1 和SULT2B1 阳性判定为胞质内出现淡黄色至棕黄色染色颗粒细胞,PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达按细胞染色所占面积和染色强度乘积计算。染色强度:无染色0 分,淡黄色1 分,黄色2 分,棕黄色3 分;染色面积:染色阳性≤10% 计1 分,11%～50%计2 分,51%～80%计3 分,＞80%计4 分。由1 名专业病理科医师采用双盲法,同一患者取2 张片阅片,取其平均数。

1.4 CD44 和CapG 蛋白测定 采用Western 印迹测定胃癌组织及癌旁组织CD44 和CapG 蛋白表达,采用RIPA 裂解液提取癌组织及癌旁组织,依据二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度,加入缓冲液后变性蛋白。按每泳道以50 μg 蛋白进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,然后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h。加入一抗后4℃孵育过夜。TBST 漂洗3 次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1 h。采用TBST 洗涤3 次,每次洗涤10 min。电化学发光(ECL)液暗室发光显影,采集图像并分析,内参选β-actin。

1.5 统计学处理 采用SPSS25.0 软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1 癌组织与癌旁组织PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达比较 癌组织 PD-L1 蛋白阳性率〔54 例(73.92%)〕 和 SULT2B1 蛋白阳性率〔47 例(64.38%)〕均高于癌旁组织〔(14 例(19.18%)、12 例(16.44%)〕,差异有统计学意义(χ2=44.042、34.832,均P＜0.001)。

2.2 癌组织与癌旁组织CD44 和CapG 蛋白表达灰度值比较 癌组织CD44 和CapG 蛋白表达灰度值(0.87±0.19、1.26±0.21)均高于癌旁组织(0.34±0.10、0.47±0.15),差异有统计学意义(t=21.091、26.155,均P＜0.001)。见图1。

图1 癌组织与癌旁组织CD44 和CapG 蛋白表达

2.3 癌组织不同临床分期PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达阳性率、CD44 和CapG 蛋白表达灰度值比较Ⅲ～Ⅳ期癌组织PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达阳性率、CD44 和CapG 蛋白表达灰度值高于Ⅰ～Ⅱ期,差异有统计学意义(P＜0.001)。见表1。

表1 癌组织不同临床分期PD-L1 和SULT2B1蛋白表达阳性率、CD44 和CapG 蛋白表达灰度值比较(±s)

表1 癌组织不同临床分期PD-L1 和SULT2B1蛋白表达阳性率、CD44 和CapG 蛋白表达灰度值比较(±s)

临床分期nPD-L1 蛋白阳性〔n(%)〕SULT2B1 蛋白阳性〔n(%)〕CD44 表达灰度值CapG 表达灰度值Ⅰ～Ⅱ期2711(40.74)11(40.74)0.46±0.140.58±0.16Ⅲ期4643(93.48)36(78.26)1.11±0.251.66±0.32 χ2 或t/P 值24.577/＜0.00110.445/＜0.00112.395/＜0.001 16.346/＜0.001

2.4 癌组织淋巴结转移情况PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达阳性率、CD44 和CapG 蛋白表达灰度值比较淋巴结转移阳性患者癌组织PD-L1 和SULT2B1蛋白表达阳性率、CD44 和CapG 蛋白表达灰度值高于无淋巴结转移,差异有统计学意义(P＜0.001)。见表2。

表2 癌组织淋巴结转移情况PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达阳性率、CD44 和CapG 蛋白表达灰度值比较(±s)

表2 癌组织淋巴结转移情况PD-L1 和SULT2B1 蛋白表达阳性率、CD44 和CapG 蛋白表达灰度值比较(±s)

淋巴结转移nPD-L1 蛋白阳性率〔n(%)〕SULT2B1 蛋白阳性率〔n(%)〕CD44 表达灰度值CapG 表达灰度值有4745(95.74)37(78.72)1.09±0.231.61±0.28无269(34.62)10(38.46)0.48±0.120.63±0.17 χ2 或t/P 值32.490/＜0.00111.833/＜0.00112.583/＜0.001 16.238/＜0.001

3 讨 论

胃癌的发生是极其复杂的一个病理生理过程,主要受多种癌基因及抑癌基因调控。由于胃癌细胞恶性程度高,增殖能力强,导致我国多数患者发现时已处于晚期〔9〕。随着我国依赖水平的不断上升,以手术为主,辅以免疫治疗、靶向治疗及放化疗等综合治疗已明显提高胃癌患者生存质量,但仍存在无法手术,耐受放化疗的晚期难治性患者,且这类患者预后极差〔10～12〕。因此,寻找胃癌相关的分子靶向标志物,为早期发现及为靶向药物开发提供参考依据。

目前认为免疫逃逸是肿瘤发生、发展的重要机制,且越来越多发现通过免疫检查解释肿瘤的免疫逃逸尤为关键。PD-L1 是40 kD 大小的一种跨膜蛋白,其功能主要是在自身免疫疾病、同种异体移植组织、妊娠过程及肿瘤组织中抑制免疫系统的功能。PD-L1 广泛表达于巨噬细胞、B 细胞、活化的T 细胞及抗原提呈细胞等,在多种人类肿瘤组织中能够检测到PD-L1 的表达〔13〕。同时,PD-L1 与其T 细胞上的受体PD1 相互作用,且在免疫应答的负性调控方面具有重要作用〔14〕。此外,PD-L1 选择性地高表达于肿瘤组织,且为肿瘤的免疫治疗提供靶点〔15〕。SULT2B1 主要位于19 号染色体长臂号染色体长臂13 区,属SULTs 超家族,其编码的蛋白质是催化类固醇系列硫酸化反应的一种关键酶,参与了细胞的脂质代谢、氧化固醇硫酸化及细胞增殖等过程〔16〕。近年来研究发现,SULT2B1 蛋白在多种恶性肿瘤中异常表达,且呈高表达〔17,18〕。本研究表明,胃癌组织中PD-L1 蛋白和SULT2B1 表达可能与临床分期和淋巴结转移呈正相关,可能随着病程的发展,患者胃癌组织内免疫抑制微环境逐渐形成。CD44 作为细胞黏附因子,其表达与肿瘤细胞的侵袭迁移能力密切相关〔19〕。CapG 是肌动蛋白结合蛋白,主要通过给微丝末端加帽控制微丝运动而发挥作用,调节细胞形态与功能,从而影响肿瘤细胞的侵袭过程〔20〕。本研究表明,胃癌患者CD44 和CapG 蛋白高表达,且与临床分期和淋巴结转移密切相关。本研究不足之处在于选取病例数偏小,统计结果可能出现偏倚,故有待扩充病例数来对本研究结论做进一步验证,提供可靠临床参考价值。

综上,胃癌组织中PD-L1、SULT2B1、CD44 和CapG 蛋白高表达,且与临床分期和淋巴结转移密切相关。