microRNA-20a靶向NOD2在老年肺癌患者结核分枝杆菌感染中的作用机制

彭定 周登峰 匡琪 (武汉市第四医院 康复科,湖北 武汉 430034; 呼吸与危重症医学)

一项全球性调查统计研究显示,每年肺癌患者约200 万例,发病率、死亡率均较高〔1〕。由结核分枝杆菌(MTB)引起的肺结核是肺癌患者最常见的并发疾病,而MTB 感染是肺癌患者手术禁忌证〔2〕,分析肺癌对MTB 感染的影响具有重要临床意义。微小RNA(miRNA)是一种单链RNA,长度约为22 个核苷酸,其在转录后的基因调控中发挥重要作用〔3〕。研究显示miR-20a 会抑制巨噬细胞对MTB的吞噬作用,然而在肺癌中,miR-20a 是否参与MTB感染仍不清楚〔4〕。含核苷酸结合寡聚化结构域的蛋白质(NOD)2 蛋白可在免疫细胞核上皮细胞中表达,可通过识别MTB 促进炎性反应激活机体的免疫反应〔5〕。而NOD2 表达受miRNA 的靶向调控〔6〕。本文拟分析miR-20a 靶向NOD2 在肺结核合并肺癌患者MTB 感染中的作用。

1 材料与方法

1.1 外周血样本 回顾性收集武汉市第四医院133 例老年肺癌合并MTB 患者样本。其中男72 例,女61 例,年龄61～77 岁,平均(68.85±3.24)岁。回顾性收集124 例老年单纯肺癌不合并MTB 感染患者为肺癌组,其中男69 例,女55 例,年龄62～79 岁,平均(69.31±3.46)岁。选择80 例健康体检者为健康组,男41 例,女39 例,年龄60～70 岁,平均(69.04 ±3.78) 岁。纳入标准:(1)年龄60～80 岁;(2)确诊为肺癌或MTB 感染;(3)知情同意。排除标准:(1)组织收集前3 个月内接受过肺癌或抗结核的相关治疗;(2)合并血液学疾病、感染或其他炎症;(3)合并其他癌症。检查患者血清样本和肿瘤组织样本。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 材料 人肺癌细胞A549(美国ATCC 公司),96 及24 孔组织培养板(美国康宁公司)。RPMI 1640 培养基核抗体(美国Gibco 公司)。miR-20a 类似物(mimic)及NOD2 过表达质粒、相应阴性对照(NC,中国吉玛公司)。Lipofectamine ®2000(美国Invitrogen 公司)。中国Aidlab 公司Trizol 试剂。中国Beyotime 公司快速定点诱变试剂盒及Renilla 荧光素酶质粒。检测仪1000 System 及荧光素酶试剂盒由美国Promega 公司提供。德国DBI Bioscience公司的BestarTMqPCR 试剂盒。美国GE Healthcare的RNAspin Mini 及miRNeasy Mini 试剂盒。美国ABI 公司ABI7900 PCR 仪。美国Thermo Fisher 公司TaqMan miRNA 试剂盒。中国碧云天公司酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒。

1.3 双荧光素酶报告检测NOD2、miR-20a 靶向关系 Starbase 得到miR-20a 及NOD2 的碱基结合位点。将野生型(wt-)NOD2 序列扩增至pGL4 荧光素酶载体,突变型(mut-)NOD2 通过诱变试剂盒得到。1×104个A549 细胞接种在24 孔板中并通过Lipofectamine®2000 将1 μg wt-/mut-NOD2 荧光素酶质粒、50 nmol/L miR-20a mimic 或miR-20a NC 质粒转染进入细胞,37℃下孵育,以Renilla 的活性检测各组细胞中相对荧光素酶活性。

1.4 RT-qPCR 患者血清中miRNA 采取miRNeasy Mini 试剂盒进行提取,cDNA 由TaqMan miRNA 反转录试剂盒形成,条件为:37℃、15 min,98℃、5 min。qPCR 实验试剂盒为TaqMan miRNA,条件为:95℃、2 min,58℃、20 s、94℃、20 s、72 ℃、20 s,进行40 个循环,72 ℃下延伸4 min。通过比较循环阈值并以U6 作为内参计算miR-20a 相对表达水平。患者细胞中的总RNA 使用RNeasy Mini 试剂盒提取,将其逆转转录成cDNA,应用BestarTMqPCR 预混液实施qPCR 实验,条件与上述相同。对比循环阈值,GAPDH 作为内参计算NOD2 mRNA 的表达水平。

1.5 ELISA 依次在患者血清中加入抗体与显色剂,酶标仪测定450 nm 处吸光度,干扰素(IFN)-γ及白细胞介素(IL)-6 、肿瘤坏死因子(TNF)-α 浓度根据标准曲线进行计算。

1.6 Western 印迹 将肿瘤组织进行研磨及裂解,离心处理,收集总蛋白,4℃,12 000 r/min 离心5 min。并通过8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离样品中等量(50 μg)蛋白质,转移至硝酸纤维素膜上。室温下,膜浸入5%脱脂牛奶,时间2 h,封闭非特异性抗原。4℃下,膜及NOD2 一抗孵育过夜,室温下,将膜和相应的辣根过氧化物酶耦联的二抗孵育1 h。采取化学发光试剂,应用Quantum One 软件处理灰度计算蛋白相对于GAPDH 表达量,计算NOD2 相对表达水平。

1.7 统计学方法 采取SPSS22.0 软件进行t检验、Pearson 相关性分析。

2 结 果

2.1 双荧光素酶报告验证miR-20a 与NOD2 的靶向关系 图1 为miR-20a 与NOD2 靶向结合位点。转染共同转染wt-NOD2 及miR-20a mimic,树突细胞中相对荧光素酶活性明显降低(P＜0.05),证实miR-20a 与NOD2 的靶向结合。见表1。

表1 双荧光素酶报告验证miR-20a 与NOD2 的靶向关系(相对荧光素酶活性,±s,n=5)

表1 双荧光素酶报告验证miR-20a 与NOD2 的靶向关系(相对荧光素酶活性,±s,n=5)

与miR-20a NC 组比较:1)P＜0.05

组别wt-NOD2mut-NOD2 miR-20a NC 组1.00±0.091.01±0.11 miR-20a mimic 组0.31±0.031)0.97±0.10

图1 miR-20a 与NOD2 mRNA 的3′端的非翻译区域的结合位点

2.2 各组IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平比较 肺癌组血清IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平显著高于健康组,肺癌+MTB 组显著高于肺癌组(P＜0.05)。见表2。

表2 各组IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平比较(±s,pg/ml)

表2 各组IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平比较(±s,pg/ml)

与健康组比较:1)P＜0.05;与肺癌组比较:2)P＜0.05;下表同

组别nIL-6TNF-αIFN-γ 13331.07±4.2648.57±6.1619.84±2.95肺癌组124 43.71±5.741) 62.49±7.951) 25.78±3.141)肺癌+MTB 组 80 65.82±7.311)2) 80.23±8.261)2) 37.56±4.561)2)健康组

2.3 感染MTB 的肺癌组织中miR-20a 和NOD2 mRNA 及蛋白表达水平和相关性 3 组肺癌组织中miR-20a、NOD2 mRNA 和蛋白表达水平差异显著(P＜0.05)。肺癌组肿瘤组织中miR-20a 显著高于健康组,而NOD2 mRNA 和蛋白表达水平显著低于健康组(P＜0.05)。肺癌+MTB 组miR-20a 显著高于肺癌组,NOD2 mRNA 及蛋白表达水平显著低于肺癌组(P＜0.05)。见图2、表3。感染MTB 的肺癌组织中miR-20a 与NOD2 mRNA 及蛋白水平均呈显著负相关(r= -0.541,P=0.006;r= -0.506,P=0.004)。

图2 Western 印迹检测各组miR-20a 和NOD2 表达

表3 各组miR-20a 和NOD2 表达比较(±s)

表3 各组miR-20a 和NOD2 表达比较(±s)

组别nmiR-20aNOD2 mRNANOD2蛋白健康组1331.00±0.141.00±0.111.00±0.11肺癌组1242.89±0.271)0.74±0.091)0.69±0.091)肺癌+MTB 组 80 4.32±0.411)2) 0.39±0.061)2) 0.40±0.061)2)

3 讨 论

肺癌的发病率和死亡率均位于所有癌症的首位,其5年生存率约为15%〔7〕。肺结核不但是诱发肺癌的发病因素之一,还会引起肺部炎症,加剧肺癌患者的免疫抑制,从而提高肺癌患者的死亡风险〔8〕,但关于肺癌患对MTB 感染的影响仍不清楚。

miRNA 可通过碱基配对识别并结合mRNA,进而诱导mRNA 的降解或抑制翻译〔9〕。miR-20a 是一种新发现的肺癌相关miRNA,miR-20a 在肺癌患者中过表达,并且促进肺癌细胞的增殖和转移〔10,11〕。miR-20a 的过表达促进分枝杆菌存活,miR-20a 下调触发巨噬细胞相关凋亡,从而促进宿主防御MTB 感染〔12〕。而miR-20a 的升高则会抑制组织免疫能力,促进MTB 感染〔13〕。Tang 等〔14〕研究结果表明miR-20a 的升高参与肿瘤患者的免疫抑制效应,抑制患者自身免疫能力。结合文献报道和本研究结果提示肺癌患者中miR-20a 的水平升高,而miR-20a 的升高能通过抑制患者的免疫能力促进MTB 的感染。

NOD2 是细胞质中细菌肽聚糖保守基序的传感器,可刺激随后的先天免疫反应〔15〕。NOD2 蛋白可通过IKK-gamma 诱导NF-kappa-B,从而促进机体对细胞内包括MTB 在内的病原体的响应〔16〕。此外,NOD2 也参与肺癌的发生和进展,研究显示肺癌组织中NOD2 的水平降低,而这会引起肺癌微环境的免疫抑制效应,从而促进肺癌进展〔17〕。有研究发现在炎症性肠病中,miR-20a 升高会通过靶向抑制NOD2 蛋白的水平参与炎性反应〔18〕。本研究结果提示肺癌组织中miR-20a 可能通过靶向抑制NOD2 蛋白表达,这不但促进了肺癌进展,还可能通过引起免疫抑制促进MTB 的感染。然而,关于miR-20a 靶向NOD2 调控MTB 感染的机制仍需要进一步的细胞实验和动物实验验证,而关于MTB 感染是否会通过miR-20a/NOD2 引起肺癌的发生也值得进一步研究。