黄土丘陵区垂直陡壁表面不同类型生物土壤结皮养分与微生物养分限制特征

2022-12-27张尚鹏王百群王香香黄倩雪喻佳洛徐明哲

水土保持研究 2022年1期

张尚鹏, 王百群, 王香香, 黄倩雪, 喻佳洛, 徐明哲

(1.中国科学院水利部水土保持研究所黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室,陕西杨凌 712100; 2.中国科学院大学, 北京 100049; 3.西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌 712100; 4.西北农林科技大学林学院, 陕西杨凌 712100)

在植被恢复的过程中，生物土壤结皮成为干旱和半干旱地区最具特色的微自然景观[1-2]，也是干旱荒漠区、极地地区等生态脆弱区植被演替的重要基础[3]。生物土壤结皮在调节土壤养分、稳定表层土壤、为土壤生物提供栖息地等方面起着至关重要的作用[4-6]。生物土壤结皮按照藻结皮—地衣结皮—苔藓结皮的顺序演替[7-8]，在某些特定环境条件下，可以跳跃地衣阶段，直接由藻结皮发育为苔藓结皮[9]。随着生物结皮的演替，生态系统中的群落组成也在发生变化，处在不同的发育演替阶段时期具有不同的生态价值，在土壤性能、抗减压力、水文过程以及固碳(C)、氮(N)效能等方面也有较大差别[10-11]。生物结皮的发育类型会影响到微生物的代谢，而微生物代谢的变化也被认为是影响土壤养分循环的最大不确定因素之一[12-13]。因此明确生物结皮发育过程中微生物的代谢至关重要。

碳、氮、磷(P)代谢是土壤微生物最重要的代谢过程，并且营养化学计量是控制微生物代谢的关键驱动力[14]。生物结皮在不同发育阶段下养分状况会存在差异[15]，当养分化学计量处于不平衡时，微生物代谢就会受到限制[16]。生物土壤结皮在不同发育阶段下微生物受到何种养分限制以及限制如何变化尚不明确。而生态酶化学计量可用于估计微生物养分需求和土壤养分供应之间的平衡[17]，用于揭示以碳、氮或磷为代表的微生物代谢限制的特征[18]。另外，在黄土垂直节理发育的陡壁上所生长的生物结皮更为集中。因此，本研究选择黄土丘陵区垂直断面上所发育的不同类型生物结皮为研究对象，探究其发育过程中的养分与生态酶化学计量特征，进一步明确在生物结皮发育过程中微生物的限制性养分与影响因素，为科学认识生物结皮的生态功能以及微生物代谢状况提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究地点位于陕西省安塞县的纸坊沟(109°15′E，36°44′N)、马家沟(109°16′E，36°50′N)和腰鼓山(109°18′E，36°51′N)3个地区。该地区是典型的黄土丘陵沟壑区，平均海拔1 200 m左右。该区年均温8.8℃，年均降水量300～650 mm，年日照时数约2 400 h，属于暖温带半干旱季风气候。土壤类型以黄绵土为主，分布的地带性植被主要有沙棘(Hippophaerhamnoides)、长芒草(Stipabungeana)、茵陈蒿(Artemisiacapillaries)、胡枝子(Lespedezabicolor)等。

1.2 样品采集

本研究于2020年8月对生物土壤结皮样品进行采集。在纸坊沟、马家沟和腰鼓山3个地区选择海拔一致，生物结皮发育完整的垂直陡壁为采样点并作为样地重复，样地的坡度均接近90°。在每个样地中，按照藓的盖度[19]采集4种类型的生物结皮：浅色藻结皮(LA)、深色藻结皮(DA)、藻藓混合结皮(AM)和藓结皮(M)(藓盖度分别为0，0%～30%，30%～70%和70%～100%)。其平均厚度分别为2.76，4.03，5.70，7.58 mm。每个采样斑块中的生物结皮应均匀分布且每个斑块间距离在2 m以上。在每个样地中，按照随机采样和多点混合的原则采集每种类型的生物结皮层，每种类型的结皮分5～7点采样，最终混合作为一个分析样。另外，采集垂直面上没有生物结皮发育的裸土作为对照处理(CK)。每个样本分为两个子样本，一份样本立即放在4℃冰箱中保存，两周内用于分析酶活性和微生物量，其他样本风干后用于理化性质分析。

1.3 样品测定

用烘干法测定土壤含水量；pH用电位法(水土比为2.5∶1)测定；采用重铬酸钾—外加热法测定土壤有机碳(SOC)的含量；凯氏定氮法测定土壤全氮(TN)含量(KjeltecTM2399，瑞典)；可溶性有机碳(DOC)和可溶性有机氮(DON)提取后由Multi C/N 3100测定。分别用浓硫酸—高氯酸和0.5 mol/L的碳酸氢钠处理土壤，用钼锑抗—紫外分光光度法测定全磷(TP)和速效磷(Olsen-P)含量(Hitachi UV2300)。采用氯仿熏蒸法测定微生物生物量[20](MBC，MBN，MBP)，将未熏蒸和熏蒸样品间的差异作为微生物量，MBC，MBN和MBP的转化系数分别为0.45，0.54，0.40。保存在4℃中的样品用来测定参与碳氮磷循环的水解酶活性。包括：β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)，β-D-纤维二糖水解酶(CBH)，β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)，L-亮氨酸氨肽酶(LAP)，碱性磷酸酶(AP)。5种酶活性均采用微孔板荧光法进行测定[21-22]，所有酶活性均以nmol/(g SOM h)来表示。

1.4 计算方法

胞外酶活性的计算公式为：

Ab=FV/(eV1tm)

F=(f-fb)/q-fs

e=fr/(csV2)

q=(fq-fb)/fr

式中:Ab为样品酶活性[nmol/(g干土h)];F是校正后样品荧光值;V是悬浊液的总体积;e为荧光释放系数;V1为微孔板每个孔中加入的样品悬浊液体积;t为培养时间;m为干土样的质量;f是酶标仪所读取样品的荧光值;fb为空白对照孔的荧光值;q为淬火系数;fs为阴性对照微孔的荧光值;fr为参考标准孔的荧光值;cs是参考标准孔的浓度;V2为所加入参考标准物体积;fq为淬火标准孔的荧光值。

利用酶计量的矢量模型计算向量长度与角度来量化微生物的养分限制特征[23]，计算公式如下：

Length= SQRT(x2+y2)

Angle(°)=Degrees[Atan2(x,y)]

式中:Length表示向量长度,值越大表示微生物相对C限制越大;Angle表示向量角度,角度小于45°表示微生物受到土壤的N限制,反之受到土壤P限制,微生物N限制随角度减小而增加,P限制随角度增加而增大。x为(BG+CBH)/(BG+CBH+AP),y为(BG+CBH)/(BG+CBH+LAP+NAG)。

1.5 数据分析

采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey test多重比较检验各处理间的差异性。采用广义线性模型来确定微生物相对C限制和相对P限制间的关系。利用R软件的“Vegan”包进行冗余分析(RDA)，利用“plspm”包中的“innerplot”函数进行偏最小二乘路径模型(PLS-PM)分析结皮类型，土壤性质和微生物量对微生物养分限制的直接和间接效应。所有分析和绘图分别在软件R(v.3.6.3)和软件Origin 2021中进行。

2 结果与分析

2.1 不同类型生物土壤结皮性质特征

不同结皮类型下的土壤理化性质存在显著差异(表1)。4种结皮类型(LA，DA，AM和M)的土壤总有机碳、全氮、全磷、可溶性有机碳、可溶性有机氮和土壤含水量均显著高于CK处理(p<0.05)，CK的速效磷含量(1.29 ± 0.08 mg/kg)在数值上也小于各个结皮类型。尽管pH在各处理间的差异不显著，但在数值上CK的pH最高(8.13±0.10)。除了DOC和pH外，藓结皮的SOC，TN，TP，DON，Olsen-P和含水量均为最高(p<0.05)，分别为(9.78 ± 0.41)g/kg，(0.87±0.02)g/kg，(0.51±0.01)g/kg，(118±6.09)mg/kg，(4.32±0.52)mg/kg，19.3%±0.75%，并且在大小顺序上均表现为M>AM>DA>LA。DOC与其他不同，DA处理最高(p<0.05)，为(304±8.07)mg/kg。总的来说，生物土壤结皮的生长促进了土壤中养分含量以及含水量的增加，并且随着裸土、浅色藻结皮、深色藻结皮、藻藓混合结皮和藓结皮的顺序逐渐增加。

表1 不同类型生物土壤结皮理化性质特征

图1为不同类型结皮的微生物量特征。CK的微生物量碳、氮、磷均为最低(p<0.05)，分别是(127±4.32)mg/kg，(6.84±1.21)mg/kg，(2.02±0.71)mg/kg。与理化性质的结果类似，藓结皮的微生物量最高(p<0.05)，其微生物量碳、氮、磷分别是CK处理的18.3，27.6，14.1倍。各处理微生物量在数值上均表现为M>AM>DA>LA>CK。可见，生物结皮的发育促进了微生物量的逐渐增加。

注：CK表示裸土；LA表示浅色藻结皮；DA表示深色藻结皮；AM表示藻藓混合结皮；M表示藓结皮。不同小写字母表示不同类型的生物结皮之间差异显著(p<0.05)。下图同。

2.2 不同类型生物土壤结皮胞外酶活性特征

生物结皮类型对土壤胞外酶活性具有显著影响(表2)。结皮下土壤胞外酶活性均显著高于裸土(p<0.05)。BG，CBH和NAG的酶活性均表现为随着LA，DA，AM和M的顺序逐渐增加，其中，M处理的CBH显著高于AM，DA和LA处理，分别是其1.83，2.14，2.19倍。LAP的最大值出现在AM处理(p<0.05)，为(1 852±125)nmol/(g SOM h)。DA处理的AP酶活性最大，为(7 387±251)nmol/(g SOM·h)，但与其他结皮类型间没有显著差异。

表2 不同类型生物土壤结皮酶活性

2.3 矢量模型分析微生物代谢特征

利用酶计量的矢量模型计算不同类型结皮的向量长度和角度来量化微生物的相对C限制与相对P限制(图2A和2B)。结果发现，CK处理表现为最低的相对C限制(0.72±0.03)与最高的相对P限制(61.0±1.19)，而M处理相反，表现为最高的相对C限制(0.89±0.03)与最低的相对P限制(55.1±1.29)。其他3种类型结皮的相对C和P限制处于二者之间且差异不显著。通过线性回归分析了向量长度与向量角度的关系发现，二者存在显著的负相关关系(图2C)，其回归方程为y=-0.02x+1.98(R2=0.61，p<0.001)。

图2 不同类型生物土壤结皮的向量长度与夹角特征及其二者关系

2.4 环境因子对生物土壤结皮酶活性及微生物养分限制的影响

利用RDA分析了生物土壤结皮下的土壤性质与土壤C，N，P获取酶的关系(图3)，土壤性质能够解释酶活性59.2%的变异，其中轴1与轴2的解释率分别为56.1%和3.10%。微生物C获取酶与土壤养分(SOC，TN，TP)和微生物量(MBC，MBN，MBP)存在正相关，P获取酶相反，N获取酶与pH间存在较强正相关。

注：C获取酶包括β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)和β-D-纤维二糖水解酶(CBH)，N获取酶包括β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和L-亮氨酸氨肽酶(LAP)，P获取酶为碱性磷酸酶(AP)。

通过偏最小二乘路径模型(PLS-PM)确定各因素对微生物C，P限制的直接和间接效应(图4A和4B)。生物结皮类型直接影响养分含量、微生物量和含水量，进而对微生物的相对C，P限制造成影响。结皮类型(+0.75)、养分含量(+0.43)和微生物量(+0.60)对微生物的相对C限制影响最大(图4C)，对微生物相对P限制影响最大的是结皮类型(-0.71)和养分含量(-0.72)(图4D)。

注：实线和虚线分别表示正向和负向影响(p<0.05)，箭头上方的数字表示标准化路径系数，R2表示每个变量解释的方差。其中，养分含量包括：DOC，DON和Olsen-P；微生物量包括：MBC，MBN和MBP。

3 讨论

3.1 生物土壤结皮的性质

生物土壤结皮的发育改善了土壤的养分状况。在本研究结果中，4种生物土壤结皮类型(LA，DA，AM和M)的总有机碳、全氮、全磷、可溶性有机碳、可溶性有机氮和土壤速效磷含量均高于裸土(表1)，与以往的研究结果类似。Elbert等[24]研究表明每年由生物结皮对C的吸收约为3.9 Pg，相当于陆地植被净初级生产力的7%，同时生物结皮显著增加了表层土壤有机碳的含量[25]。生物结皮对氮元素的固定起着重要作用，Russow等[26]通过研究生物结皮和大气氮沉降的关系，发现大气中84%以上的氮可以通过生物结皮进行固定；而生物结皮中的蓝藻和蓝藻共生地衣，能够将大气中的N2固定为可被植物利用的氮进入土壤，增加了表层土壤N的输入[27]；此外，明姣等[28]研究发现生物结皮的形成显著的提高了土壤全氮的含量，并且对土壤中氮素的贡献主要集中在结皮层。生物结皮的发育也可以加速土壤有效磷的积累，一方面生物结皮分泌的有机酸能够溶解磷酸盐而释放磷；另一方面，生物结皮通过提高结皮层土壤碱性磷酸酶的活性和有机质含量，降低土壤pH，进而提高了土壤磷素有效性[29-30]。尽管在本研究中各处理间的pH没有显著差异，但是各结皮处理的pH均小于裸土，这与上述结果是一致的。

与裸土相比，4种类型的生物结皮生长显著增加了微生物生物量碳氮磷(p<0.05，图1)。这与本研究中土壤养分和土壤含水量的变化是一致的，在适宜的养分与水分条件下，可以为微生物的生长提供有利的条件[14]，偏最小二乘路径模型结果也展示出养分含量对微生物量的直接作用更为显著(图4)。当然，微生物的生长也可以促进养分的积累和水分的涵养[31]。生物结皮一般会按照藻结皮—地衣结皮—苔藓结皮的顺序演替[7-8]，在本研究中土壤养分、水分和微生物量均随裸土、浅色藻结皮、深色藻结皮、藻藓混合结皮和藓结皮的顺序逐渐增加，反映出在生物结皮发育过程中有助于土壤性质的改善。

3.2 生物土壤结皮的酶活性和微生物养分限制

参与C，N和P循环的相关酶活性均表现为结皮的酶活性显著大于裸土(p<0.05，表2)，这表示微生物在生物结皮中的C，N，P代谢速率更快，与微生物量的结果相对应。此外，以往的研究表明，土壤酶活性受到土壤养分状况影响较大[32]，并且在养分匮乏时微生物可以分泌酶到环境中来获取所需的养分[33]。本研究中，RDA结果表明土壤的养分状况(SOC，TN和TP)与酶活性存在较强的相关性，并且能够解释酶活性大部分的变异(图3)。因此不同结皮类型间的养分差异会影响到土壤酶的活性。

酶计量的矢量模型结果表示在各个类型下微生物均受到相对C限制和相对P限制，并且微生物相对C，P限制间存在显著负相关关系(图2)。其中裸土的相对C限制低于各结皮处理，而相对P限制高于各结皮处理(图2A和2B)。这可能是由于土壤本身的P元素较为匮乏，不能满足微生物生长需求，并且从裸土发育到浅色藻结皮、深色藻结皮和藻藓混合结皮的过程中，土壤速效磷含量并没有显著变化(p>0.05)。P元素的限制也会影响到微生物对其他养分的吸收和微生物代谢[34]。为了缓解P限制，微生物群落在分泌与P代谢相关的酶时会消耗掉一定的C[35]；有机质分解也会释放P供微生物利用[36]，微生物需要分泌更多的C获取酶水解有机质来缓解自身P的限制，这些过程都会导致微生物相对C限制的增加。此外，从裸土发育到结皮的过程中，微生物量显著增加，微生物间对资源的竞争也会造成相对C限制的加剧。

在浅色藻结皮发育到藓结皮的过程中，尽管相对C限制在各类型间差异不显著，但是数值上表现为先降低后增加的趋势。DA处理的相对C限制最低，其可溶性有机碳含量在此时是最高的(表1)。Sinsabaugh等[33]指出速效养分对微生物生长影响更大，高的养分可利用性一定程度上能够缓解微生物的养分限制[18]。同理，藓结皮的速效磷含量最高而P限制最低，与此观点是一致的。并且偏最小二乘路径模型结果也展示出速效养分含量对相对C，P限制均有较大影响。另外，土壤水分在低水平时的微生物代谢活性会受到抑制[37]，在裸土和结皮发育初期的水分含量很低，微生物对有机物质的分解较慢也会造成较高的磷限制。结合偏最小二乘路径模型的结果来看，生物结皮的类型会直接影响到土壤中的养分状况、水分和微生物量进而间接影响微生物的代谢限制。本文主要基于酶活性及其计量模型对于微生物代谢情况进行判断和分析，在后续工作中需要结合微生物的群落特征以及参与碳氮磷循环的功能基因特征进行更全面以及深入的探讨。