水稻细菌性褐条病研究进展

方 媛, 潘晨阳, 李梦佳, 袁李亚男,王 盛, 程琳乔, 饶玉春

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

水稻(Oryzasativa.L)，禾本科稻属，一年生单子叶植物，主要分布于亚洲和非洲的热带及亚热带地区，是中国及其他许多国家的主要粮食作物.据报道，世界上有半数以上的人口以水稻为主食，除去自然因素外，水稻病虫害是影响水稻高产稳产的主要因素之一.水稻细菌性褐条病(rice bacterial brown stripe)，又被称为水稻细菌性心腐病，是我国南方双季稻区的常见病害，在浙江、江苏、福建、贵州、湖南等省份均有分布[1].主要引起秧苗叶片和叶鞘上的褐色条斑，并伴有早穗、高穗、畸形穗、不实率增加等症状，严重时会使水稻心枯而死.在常见的水田中，感染RBSS的病株率为20%～25%，病害发生严重，幼苗死亡率可达60%以上[2].该病害最早于1956年在日本九州由Goto[3]发现，随后几十年一直是植物病理学家的研究热点.我国最早报道水稻细菌性褐条病是在1975年，江西省修水县发生百年特大洪水，雷国明[4]在调查中发现，大面积水淹区的早稻田发生细菌性褐条病.2008年，广西合浦县发生连日暴雨，局部地区晚稻发生严重细菌性褐条病，植株发病率高达56%，产量损失惨重[5].

目前，国内外对水稻细菌性褐条病的研究主要集中在植物生理生化检测及光学显微镜观察水平上，在病原鉴定及致病机理上有少数报道，但对其分子生物学水平上的研究还尚不深入.

1 病原菌

水稻细菌性褐条病自1956年被发现以来，其病原菌的命名经历了多次演变，最初的报道将其认定为丁香假单胞菌致病变种(Pseudomonassyringaepv.panici)，后经过细菌学分类鉴定，将其确定为燕麦假单胞菌(Pseudomonasavenae).随着研究者对细菌分类的不断深入和完善，假单胞菌属(Pseudomonas)中的非荧光菌独立出来形成多个属，其中avenae被归入嗜酸菌属(Acidovorax)并被命名为燕麦嗜酸菌燕麦亚种(Acidovoraxavenaesub.avenae)，该亚种包含可引起麦类细菌性褐条病和引起水稻细菌性褐条病的2种病原，因此,将其中引起水稻褐条病的病原物确立为Acidovoraxoryzae，即水稻嗜酸菌[6].

燕麦食酸菌燕麦亚种为革兰氏阴性细菌，菌体单胞杆状，大小为(0.9～2.5) μm×(0.5～1.0) μm，无芽孢、荚膜，极生鞭毛1～2根.在琼脂培养基上菌落圆形、白色半透明隆起、边缘整齐、表面光滑、无荧光[7].燕麦食酸菌燕麦亚种寄主多样，还可侵染甘蔗、蝴蝶兰等多种经济作物.

2 发病症状

水稻细菌性褐条病的发生与气温高低、稻苗受淹程度、生育期及品种抗性等因素有关.侵害对象可包括幼苗、叶鞘、心叶、穗部、成株叶片等，且在水稻苗期至穗期均可能被侵害，具体见图1.

图1 水稻褐条病发病症状

褐条病主要在秧苗1～4叶期发生，幼苗受侵染后从第1片真叶萌发开始显示症状.先在叶枕上出现褐色小斑，后扩展形成紫褐色长条斑，有时与叶片等长，边缘清楚，发展到后期病苗枯萎或病叶脱落，导致植株停止生长甚至枯死.根据病原菌侵染部位的不同，褐条病的发病症状可分为3种：1)病原菌感染已伸长节部的较老叶片时为普通型，初期叶片与叶鞘交界处产生水渍状褐色斑点，随后沿中脉上下延伸成长条状，最后全叶鞘呈现黄褐色水渍状腐烂，严重时叶片失水纵卷枯黄；2)病原菌入侵节间未完全伸长的节部叶片时为伸长型，其叶片与叶脊的症状与普通型相似，但叶鞘基部下一节间会有明显伸长，最终叶鞘大多腐烂枯死，病叶从叶鞘中部折断而枯黄；3)病菌侵害刚露尖的心叶时为心腐型，病菌常从叶枕处侵入，发病初期导致稚嫩心叶产生水渍状腐烂，后迅速上下扩展为深褐色长条，致使幼嫩叶鞘腐烂，心叶青卷，随后变成褐色枯心[8].上述3种类型的病组织均极易折断，用手挤压会溢出乳白色至淡黄色菌脓，A.oryzae菌液无味.

病株大多在抽穗前枯死，少数存活下来的病株常提早抽穗.孕穗期穗苞染病导致穗早枯，穗颈异常伸长，小穗梗淡褐色且弯曲畸形，谷粒呈褐色不实，部分稻穗或还未伸长就从剑叶叶枕下破叶鞘而出，或裹在叶鞘内成“闷死胎”[7-8].

3 发病机制

水稻细菌性褐条病菌(A.avenaesub.avenae)致病过程复杂，有各种致病生化因子参与.研究者借助遗传学手段发现各种胞外多糖、脂多糖、水解酶类、蛋白酶及各种毒素均参与了A.avenaesub.avenae的致病.目前研究发现，褐条病菌具有分泌多种效应子的新型分泌系统——Ⅵ型分泌系统(T6SS)，该系统通过精细的装置将细菌分泌的蛋白运输到胞外或直接运输到寄主细胞中，干扰或刺激寄主细胞的正常生命活动，从而调控寄主与病原菌之间的相互作用[9].

3.1 Ⅵ型分泌系统(T6SS)

细菌Ⅵ型分泌系统近几年才被发现并成为研究热点，它普遍存在于革兰氏阴性致病菌中并与细菌的致病性有关，水稻细菌性褐条病菌也有T6SS.T6SS是由结构蛋白、效应蛋白、调节蛋白和分子伴侣蛋白构成的蛋白复合体[10].典型的T6SS由IcmF,DotU等蛋白构成的跨膜结构横跨于细菌的细胞内膜-周质-外膜[11].T6SS的结构蛋白不仅包括编码细胞内增殖蛋白的IcmF和DotU，还包括脂蛋白ClpB AAA+ATP酶、外膜蛋白OmpA、溶血素共调节蛋白Hcp和缬氨酸-甘氨酸重复蛋白VgrG[12].目前有关T6SS影响细菌毒力的报道屡见不鲜，例如含有T6SS的副溶血性弧菌(Vibrio.parahemolyticus)与霍乱弧菌(V.cholerae)具有较强的致病毒性[9].2014年，单长林[13]在研究T6SS的效应子VgrG蛋白时，通过同源重组敲除特定的基因获得水稻细菌性褐条病菌的突变体，并证明了可通过调控T6SS的VgrG蛋白来控制水稻细菌性褐条病菌的致病性.Zhang等[14]也对T6SS的脂蛋白ClpB的功能进行了研究，发现clpB基因被敲除后能够严重影响水稻细菌性褐条病菌RS-1菌株的生长、毒力和EPS合成，充分说明它在病菌的致病过程中发挥了重要作用.2017年，杨樱子[15]进一步证实了T6SS 中pppA,clpB,hcp,dotU,icmF,impJ,imp和vgrG(1～8)共15个基因可能通过减少Hcp蛋白的分泌起到减弱毒力作用，清楚地揭示了T6SS在水稻细菌性褐条病菌致病机制中的作用.具体见图2.

图2 T6SS中不同功能的蛋白质分类

3.2 生物膜

无论是在人工条件还是自然条件下，水稻细菌性褐条病菌都倾向于形成细菌生物膜而不是成为浮游细菌.生物膜是细菌性褐条病菌为了更好地适应自身所处的环境所形成的，在生物膜上存在的一些胞外基质如脂类、磷脂、蛋白质、DNA、RNA、多糖等使其可以附着于生物或非生物的表面，并聚集成群.Ibrahim等[16]研究A.avenaesub.avenae病菌外膜在体内外蛋白的差异表达时发现外膜蛋白在褐条病菌发病过程中起着重要作用.生物膜就是细菌性褐条病菌抵抗外界不良环境的天然屏障，这使得病菌在侵害生物体时对宿主的防御系统具有天然的抵抗力，所以生物膜在水稻细菌性褐条病菌侵染植物体并完成病害循环中起到极其重要的作用[17].

3.3 胞外酶

水稻细菌性褐条病病菌在生命活动中会产生各种不同的胞外酶进入胞外基质中，包括蛋白酶、胞外磷脂酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等降解酶[8]，这些降解酶通过降解植物原有的抗侵染物理屏障及在摄取宿主营养中起到非常重要的作用.陈磊[18]在2008年研究水稻黄单胞菌双精氨酸运输(Tat)系统关键基因的克隆与功能分析时，证明了不同的病原菌会对降解酶进行不同的组合，从而改变病原菌的致病性.

3.4 胞外多糖

胞外多糖(expolysaccharides,简称EPS)是细菌在生长代谢过程中分泌到胞外的一种多糖类化合物，有的依附于细菌细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的渗入培养基形成黏液，称为黏液多糖，它们都是细菌适应环境的产物.胞外多糖有助于细菌吸附于寄主上并吸收其营养，也有助于抵抗干旱环境，同时也是毒力因子之一.胞外多糖与寄主细胞降解物一起堵塞维管组织，引起植物坏死、萎蔫、褪绿.不产生胞外多糖的菌株不具有致病性，原因是寄主可以识别并清除不具有胞外多糖的细菌.胞外多糖与细菌致病性之间有着密切的联系，作为重要的致病因子，胞外多糖的致病机制可能是：1)黏稠的胞外多糖堵塞维管束的运输道路；2)干扰寄主的免疫识别；3)提高菌体的抗性.许多植物病原菌的EPS已被证明是毒力因子，如青枯假单胞菌、甘蓝黑腐病菌、梨火疫病菌等[19]，而邱慧[20]在2014年研究水稻细菌性褐条病菌clpB和impM基因的致病性及氧胁迫条件下全蛋白的表达分析时也发现，褐条病菌胞外多糖的含量增加会使其致病性增强.

4 抑菌物质

抑菌物质可分为壳类糖、喜树碱(camptothecin，CPT)及β-内酰胺类抗生素(β-lactams)3大类，其具体作用机理详见表1.

4.1 壳聚糖

2015年，杨春兰[7]在进行水细菌性褐条病菌lipo和pppA基因功能及壳聚糖的抑菌机理的研究中发现,壳聚糖对水稻细菌性褐条病具有明显的抑制作用.有研究表明，由于壳聚糖的表面带一定的正电荷，可以与细菌性褐条病菌表面的负电荷进行相互作用，改变细胞的通透性从而对细胞造成损伤[21].也有另外的研究表明，由于壳聚糖自身的理化性质比如壳聚糖的亲水性，能螯合金属，可以与DNA结合抑制RNA的合成，可以对微生物的生长造成较强的抑制作用[22].

4.2 喜树碱

喜树碱是从喜树中分离得到的一种单体的有效成分，也是世界上三大抗癌药物之一.2016年，Dong等[23]在芸薹根肿菌近红外光谱检测体系及喜树碱抑菌机理的研究中发现，CPT对水稻细菌性褐条病菌株的细胞活性和游动性抑制作用较为显著，而细菌的游动性与细菌的繁殖扩增毒力密切相关.在CPT处理过的细菌菌株超薄切片电镜观察中发现，菌体表面由光滑变成粗糙，细胞大部分内质物被降解，并形成了气泡，表明CPT对褐条病菌的细胞结构具有明显破坏作用.

4.3 β-内酰胺类抗生素

β-内酰胺类抗生素是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，具有杀菌活性强、毒性低、临床疗效好的优点[24].2015年，葛梦禹[25]在RNA-Seq解析毒力抑制剂弱化水稻细菌性褐条病菌致病力的研究中发现，β-内酰胺类抗生素Amp可以显著地弱化细菌性褐条病菌(菌株RS-1)的游动性，以及病菌在水稻根部的定殖能力.

5 防治措施

水稻细菌性褐条病发病严重、防治困难，目前生产上采取的防治措施主要有农业防治、化学防治、生物防治等.虽然这些措施起到了一定的防治作用，但却不能从根本上减少水稻细菌性褐条病的发生.近几年来，随着分子生物学和生物信息学的快速发展，该病菌致病机制及其与水稻互作机制逐渐探明，植物病理学家提出了一些能防治该病害的方法，具体见表2.

5.1 农业防治

防治任何一种作物病害，搞好农田基本建设是首要任务.及时改善加固水利排灌网管，疏浚沟渠，优化地面排涝和灌溉系统配套，保障农田出流畅通，可以避免田间积水.一旦稻田淹没，就要立即排水晒田，防止病害发生流行，同时还要对防洪工程进行修复.此外合理搭配施用有机肥，控制氮肥用量，适时适度露晒稻田，及时处理病稻草等，均能降低病害发生程度[26].

5.2 化学防治

带菌种子是该病害传播的主要途径，因此在播种前就要对种子做好消毒工作.目前生产上常用的消毒液有强氯精、链霉素药液和抗菌剂等.对于已经发病的农田，要依据发病情况轮换、单用或者混合使用高效对口农药，可供选择的药剂有喹啉铜、独定安等[27].如果病情严重，要立即每公顷撒施石灰或草木灰15～20 kg，喷洒20%噻森铜SC、20%叶青双可湿粉125 g兑水喷雾、95%细菌灵可湿性粉剂500倍液或50%代森铵水剂800倍液等药剂，防效均可达90%以上，但喷雾时要尽量喷到茎秆上，并适当追施氮肥[1].

5.3 生物防治

目前对水稻细菌性褐条病生物防治的研究主要侧重2种方法.一是对病原菌致病相关基因进行定位、分析，通过减弱病原菌的毒性来达到防治褐条病的效果.刘贺[1]研究发现，将细菌鞭毛作为药剂的靶标位点，对该病害的防治或将起到良好的效果.二是筛选抗病品种，并将筛选出的抗病品种培育成更适应气候条件的抗褐条病主栽品种，以期极大降低褐条病的发病率.

表2 水稻细菌性褐条病防治措施

6 总结与展望

水稻是我国及其他国家最主要的粮食作物之一，其重要性不言而喻.在我国水稻生产中，细菌性褐条病已经造成了严重的不良影响.近年来，我国不少水稻产区相继爆发了水稻细菌性褐条病，并且造成了严重的经济损失.然而，目前对该病的研究大多集中在病原菌的分离与鉴定、病原菌致病基因的挖掘和致病机理的探究等方面.例如，目前已经发现的细菌Ⅵ型分泌系统、生物膜、胞外酶等与细菌性褐条病菌的致病性密切相关.然而，关于细菌性褐条病的抗原筛选、抗性鉴定、水稻对该病的抗病机制研究及抗性基因的挖掘等方面还处于空白，导致水稻抗病遗传育种工作的进展缓慢.

目前对水稻细菌性褐条病的防治主要采取的方法有农业防治、化学防治和生物防治等.为了从根本上找到更加有效的病害防治方法，应该彻底阐明该病菌的致病机理及其与水稻的互作机制，对影响致病性的基因进行定位和功能分析，并且在之后的研究中发掘到相应的褐条病抗性位点，筛选出效应值较大的位点，并通过常规的分离手段，缩短这些位点间的物理距离，在大田中构建这些位点的近等基因系NIL，然后进行多个抗性QTL的聚合，最终应用于抗褐条病育种工作，如此便可极大地防治水稻细菌性褐条病.这种方法是纯有机的，既能保证农业生产的绝对安全，也有利于提高水稻品种的经济价值.