中性粒细胞在肺动脉高压发病中作用的研究进展*

冶 怡， 乌仁塔娜， 吴金春， 格日力△

（1青海大学高原医学研究中心，高原医学教育部重点实验室，青海省高原医学应用基础重点实验室，青海-犹他高原医学联合重点实验室，青海 西宁 810001；2青海省人民医院，青海 西宁 810001）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是指由多种异源性疾病（病因）和不同发病机制所致的肺血管结构或功能改变，引起肺血管阻力和肺动脉压力升高的临床和病理生理综合征，继而发展为右心衰竭甚至死亡。2018年第六届世界肺动脉高压大会（World Symposium on Pulmonary Hypertension，WSPH）将PH 血流动力学诊断标准更新为：海平面、静息状态下，经右心导管检查测定的平均肺动脉压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）＞20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）［1］。近期流行病学研究表明，PH 不是罕见疾病，全球PH患病率约1%，其中65岁以上人群的患病率高达10%［2］。WSPH 将PH 分为（1）动脉型 PH（pulmonary arterial hypertension，PAH）；（2）左心疾病所致PH；（3）肺部疾病和（或）低氧所致PH；（4）慢性血栓栓塞性PH（chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH）和（或）其他肺动脉栓塞性疾病所致PH；（5）原因不明和（或）多因素所致PH。各类PH 存在相似的病理学特征，例如肺血管持续性收缩，血管壁重塑及原位血栓形成；组织学研究表明重塑的肺动脉周围伴有血管周围炎症及蛋白酶水平升高。其中，炎症反应在PH 的病理生理中发挥着极为重要的作用［3］，而中性粒细胞是参与其中的重要组分［4］。

中性粒细胞是人体含量最多的天然免疫细胞，是固有免疫防御的第一道防线。在炎症或损伤发生时，中性粒细胞从血液中被募集，从血管内游出并趋化到病灶，吞噬杀伤病原微生物或变异细胞。

Tuder 等［5］于 1994 年首次报道 PH 患者病变肺血管周围出现大量免疫细胞浸润及补体、免疫球蛋白的沉积；之后在各种类型的PH 患者和PH 动物模型中证实中性粒细胞水平的显著增加［6］，且增加的中性粒细胞可影响反映疾病进展的临床标志物水平，例如肺血管阻力增加及6 min 步行距离减少［7-8］。中性粒细胞在PH 病程中归巢到肺组织后，不仅参与肺血管炎症［9］，还能够通过脱颗粒释放细胞因子及蛋白酶而介导肺血管重塑［10］。上述研究结果提示中性粒细胞与PH 的病理生理学之间的潜在联系。本文就中性粒细胞在PH 发生与发展的作用及其分子机制的研究进展作一综述，尝试为PH 发病机制的认识及治疗提供参考资料。

1 中性粒细胞在PH中的募集

PH 血管周围炎症介导内皮、平滑肌及炎症细胞产生细胞因子，同时蛋白酶降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）［11］。细胞因子的大量分泌和ECM 降解释放的肽类能够引起循环免疫细胞的激活和募集［12］，其中，中性粒细胞是首先招募到炎症部位并参与血管重塑的重要成分。炎症状态下，中性粒细胞被白细胞介素8（interleukin-8，IL-8/CXCL8）等趋化因子激活，使其在流动条件下牢固黏附于内皮细胞，随后在内皮管腔表面移行，并从血管渗出，依赖趋化因子的浓度梯度最先到达炎症部位。大量研究观察到PH 患者与PH 动物模型外周血及肺组织中中性粒细胞增加［13］，且不同类型PH 中，中性粒细胞水平升高程度不同，其中以 3 型 PH 最为显著［14］。Tian等［15］在PAH 患者肺部的丛状病变中观察到巨噬细胞，而活化的巨噬细胞能够促进中性粒细胞募集。Soon 等［8］表明在 PAH 患者血浆 IL-8 水平升高的情况下，基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）失活促进中性粒细胞进入循环。Florentin等［10］证实PH 中性粒细胞在骨髓动员、血液循环和肺组织募集三个阶段均有显著增加，进一步揭示了PH患者肺脏浸润的中性粒细胞来源于骨髓，其机制为IL-6上调中性粒细胞上CX3CR1的表达，从而促进中性粒细胞从骨髓迁至肺脏。此外，研究强调募集于肺组织的中性粒细胞促进小鼠的肺动脉压升高及肺动脉重塑。

2 中性粒细胞在PH中的分泌

2.1 IL-1β 在 PH 中的作用 IL-1β 是一种重要的细胞因子，是炎症反应的重要介质。在PH 患者中检测到血清 IL-1β 水平升高，且升高的 IL-1β 水平影响疾病预后［11］。Cero 等［16］的研究表明，在慢性低氧诱导的PH 小鼠肺血管中浸润的中性粒细胞能够分泌IL-1β，且在小鼠中敲除 IL-1β 受体，或使用 IL-1β 受体抑制剂［17］可减轻野百合碱诱导的PH 动物模型中肺动脉压的持续升高和右心室收缩压的显著降低。在肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）中，前列环素调节血管舒张并具有抗增殖作用。这种血管舒张作用是通过第二信使环磷酸腺苷（cyclicadenosine monophosphate，cAMP）介导的。IL-1β通过下调腺苷酸环化酶来减弱PASMCs中ATP 向 cAMP 的转化［18］。此外，IL-1β 可以通过 IL-1R1/MyD88通路调节PASMCs的生长［19］。因此，作为一种潜在的作用机制，中性粒细胞分泌的IL-1β可能直接调节肺动脉的血管收缩和重塑。在PH 的情况下，中和IL-1β、抑制IL-1β 信号传导或抑制调控IL-1β分泌的上游途径可能有效地减轻疾病进展。

2.2 中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）在PH 中的作用 中性粒细胞是血管周围炎症发生后被招募的细胞之一，也是多种蛋白水解酶的潜在细胞来源，释放具有酶活性的NE、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、组织蛋白酶G（cathepsin G）、基质金属蛋白酶 1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、MMP-8、MMP-9及MMP-12等参与不同的炎症过程［20］。NE 是中性粒细胞活化后释放的一种重要的丝氨酸蛋白水解酶，是中性粒细胞储存并释放的众多蛋白水解酶中水解功能最强、最重要的一种。有证据表明从PAH 患者中分离出的中性粒细胞中NE 释放增加［9］。同时，也观察到 PAH 患者和 PH 动物模型中内源性NE的上调［21-22］。体外研究表明人类肺泡巨噬细胞通过摄取凋亡的中性粒细胞将NE 内化，并将其转运至组织并随后释放活性形式［23］。在实验性PH 大鼠模型中，增加的NE 活性进一步加剧肺血管病变［24］。此外，中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）由NE 和其他抗菌蛋白酶修饰的解聚染色质组成，强调PAH 中的高NETs水平可能是活性NE的重要来源［25］。

NE 是参与PH 发病的重要介质。在实验性PH大鼠模型中，NE 活性增加与血管病变有关［24］，且抑制NE 活性不仅可以减缓野百合碱诱导的PH 模型的进展，还能够改善PH 血流动力学变化，逆转疾病过程［26］。Kim等［21］使用过表达S100A4蛋白的转基因小鼠进一步明确了NE 诱导新生血管内膜形成，且输注重组Elafin（内源性NE 抑制剂）减少了PH 模型中新生血管内膜损伤的数量及严重程度。Nickel 等［27］观察到在Sugen5416联合低氧诱导的PH大鼠模型的肺组织中，NE 活性增加，且应用Elafin 抑制其活性能够改善内皮功能、减少肺小动脉重塑并降低肺动脉压力，抑制NE活性可作为治疗PH的新靶点。

NE 的释放不仅能够降解弹性蛋白，还可以通过降解几乎所有ECM 成分（包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白）刺激肺血管重塑，从而诱导PH 的发生与发展［28］。降解的ECM 释放生物活性肽和生长因子，例如表皮生长因子和成纤维细胞生长因子［29］，促进 PASMCs 和成纤维细胞的增殖与迁移［30］，以加重PH 肺血管重塑。增强的NE 活性导致MMPs 激活，通过增强ECM 降解和诱导生腱蛋白C（tenascin C）生成，促进tenascin C 与纤连蛋白的内皮下沉积，介导PASMCs 迁移及新生血管内膜的形成。同时，抑制NE会导致tenascin C 减少，诱导PASMCs凋亡并改善肺小动脉不良重塑［26］。

除了促进PASMCs 增殖与迁移外，NE 还通过细胞因子的蛋白水解修饰参与PH 的发病机制。例如，NE 通过水解人冠状动脉内皮细胞中无活性的IL-1β前体，增加中性粒细胞胞外囊泡中活性IL-1β 的分泌［31］，同时活性IL-1β 可促进中性粒细胞活化［32］。因此，中性粒细胞、NE 与IL-1β 之间形成正反馈环路，介导PH 发生。此外，NE 还能够水解SDF-1，参与调节骨髓中性粒细胞的释放［33］。研究表明，在PAH 患者血浆IL-8水平升高的情况下，SDF-1失活促进中性粒细胞进入循环［34］。

因此，PH 患者与动物模型中NE 的增加及其肺血管壁中层弹性纤维的破坏明确了蛋白水解酶，特别是NE 的关键致病作用，NE 通过调节细胞因子的活性及降解ECM 而释放促进PASMCs 重塑的生长因子来参与PH 发病机制。此外，NE 的释放可能会改变局部炎症环境，增强中性粒细胞活性，并进一步推动PH异常免疫炎症。

2.3 与PH 病变有关的其他蛋白酶的作用 PH 病变中MMPs 的失调与多种病理生理过程有关［35］。例如，特发性肺动脉高压（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者肺组织中MMP-2 的生成及活性增加，同时 MMP-3 减少［36］。PAH 患者的肺小动脉丛状病变［37］及野百合碱诱导的PH 大鼠的肺组织［38］中MMP-9表达上调。George 等［39］通过构建野百合碱诱导的MMP-9转基因小鼠进一步证实，MMP-9的过度表达加剧了野百合碱诱导的小鼠肺组织炎症细胞浸润、肺小动脉重塑及肺动脉压升高。此外，MMP-2 和膜型MMP-1 大量表达于具有丛状病变的PAH 患者的肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）中，同时 MMP-3 和 MMP-7 的表达在增殖的肌成纤维细胞中显著升高［40］。MMPs 参与PH 疾病进展的机制主要为：MMPs 通过促进PAECs 迁移，PASMCs 迁移和增殖，外膜成纤维细胞的转分化，ECM 生成及炎症细胞募集，介导难以逆转的肺血管重塑。

活化的中性粒细胞能够脱颗粒并释放储存于嗜天青颗粒中的MPO，其主要功能是利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐，并形成具有氧化能力的自由基，构成MPO-过氧化氢-卤素系统，进而杀伤病原微生物。Rose 等［9］在 PAH 及 CTEPH 患者中检测到血浆MPO 水平升高，且影响PH 的严重程度及临床结局。新近研究表明，PAH 患者的血浆和肺组织中MPO 水平升高，且MPO 促进肺动脉压力升高及肺小血管肌化；此外，抑制Sugen5416联合低氧诱导的PH大鼠体内MPO 水平，进一步揭示了MPO 通过激活RhoA/Rho 激酶途径促进肺血管收缩，诱导肺血管重塑，说明MPO在PH发病机制中发挥重要作用［41］。

总之，PH 中升高的大量细胞因子可增强中性粒细胞的数量与功能，同时中性粒细胞脱颗粒可介导PH 血管炎症持续存在。PH 患者的血管周围炎症表型以循环及组织中细胞因子水平升高为特征，且与中性粒细胞的持续活化一致。

3 NETs在PH中的作用

中性粒细胞可以通过3 种主要不同机制对刺激作出反应：吞噬作用、释放含有蛋白酶和活性氧的颗粒及NETosis（即中性粒细胞生成NETs 的过程）。NETs 是有别于细胞凋亡与坏死的死亡形式［42］，活化的中性粒细胞能够向细胞外释放由解聚的染色质和细胞内颗粒蛋白组成的NETs，如瓜氨酸化的组蛋白H3、MPO、NE、cathepsin G 等。NETs的形成和存在是一种慢性、低度的炎症反应。然而，近年来研究显示，NETs 在多种非感染性急、慢性疾病中也具有重要的致病作用［43］。与PH 发病机制有关的因素，如氧化应激、IL-8［44］、NE、MPO、高迁移率族盒蛋白 1［45］（high mobility group box protein 1，HMGB1）、肿瘤坏死因子α、核糖核蛋白复合物等可在体内、外诱导NETosis［46］。例如，PH 患者与 PH 动物模型的血清及肺组织中HMGB1 升高，且HMGB1 含量影响mPAP水平［19，47］，随后，通过构建 Toll 样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）基因敲除的 PH 模型小鼠明确HMGB1 通过激活TLR4 参与肺血管重塑及右心室肥厚的发生发展［45］，提示 NETosis 与 PH 的病理生理学之间的潜在联系。

目前已在 PAECs 凋亡［48］及血栓形成［49］有关的PH 血管病变中检测到NETosis。并且，Aldabbous等［50］首次在 IPAH 与 CTEPH 患者的血浆、闭塞的丛状病变及原位血栓中观察到大量活化的中性粒细胞及NETs；并且，通过血管生成模型，体内、外基质胶血管生成实验证实NETs 促进内皮血管生成，并伴有PAECs通透性增加，PAECs与PASMCs的增殖及迁移能力增强，并且进一步表明NETs 诱导的肺血管重塑依赖于MPO/TLR4/NF-κB信号通路的激活。

由此可见，NETs 可能通过不同的途径促进肺血管重塑，其介导的肺血管稳态失衡或对不同类型的PH疾病具有潜在的影响。

4 中性粒细胞在PH中的的预后价值

中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）是反映体内免疫平衡失调和全身炎症反应的潜在生物标志物。近年来研究表明其与心血管系统疾病，自身免疫性疾病、恶性肿瘤及新型冠状病毒肺炎［51］中 NLR 水平升高。在 CTEPH［52］与IPAH 中，NLR 影响肺血管阻力增加及临床预后［53］。NLR 在伴有 PH 的紫绀型先天性心脏病［54］及结节病［55］中显著升高并影响肺动脉收缩压及术后不良结局。因此，NLR 可作为预测PH 患者预后的有效生物标志物。

5 靶向中性粒细胞对PH的作用

目前针对中性粒细胞治疗PH 的研究发展迅速，涉及多个方面，并在细胞实验及动物模型中都证实了疗效，有望成为未来PH治疗的关键靶点。

IL-1β是肺血管中性粒细胞介导PASMCs增殖的关键信号通路，通过基因［16］或药物抑制IL-1β［17］可延缓PH的发生发展。

中性粒细胞脱颗粒后释放的NE 在多种动物模型中主要参与肺血管重塑，应用小分子制剂抑制NE［26］或使用内源性 NE 抑制剂 Elafin［56］可使肺动脉压力及肺血管结构正常化。然而，除了阻断NE 作用外，研究证实Elafin可增强骨形态发生蛋白信号传导并抑制NF-κb 活性，从而在PH 中提供了更加强效的抗炎作用。目前，评价Elafin 抗PH 治疗的安全性与有效性的临床试验（NCT03522935）已如期开展，旨在探索PH人群的更优药物疗法。

HMGB1/NETs/TLR4 信号通路参与肺血管重塑，加重血管壁增厚，增加肺血管阻力，导致PH 的发生发展。P5779 通过特异性抑制HMGB1 与TLR4 之间的相互作用，可逆转Sugen5416 联合低氧诱导的PH大鼠升高的肺动脉压，并改善右心室收缩压、右心室功能障碍及肺血管重塑［47］。此外，利用DNase I 降解NETs后，NETs诱导的促血管生成反应及肺血管重塑减弱。因此，靶向HMGB1/NETs/TLR4 通路可作为PH防治的新思路。

综上所述，以肺血管周围中性粒细胞的浸润为特征的炎症反应是PH 的关键致病因素。中性粒细胞在PH 病程中募集到肺血管及周围组织，不仅参与肺血管炎症，还能够通过脱颗粒释放细胞因子、蛋白酶，甚至以NETosis 的程序性死亡介导肺血管重塑。靶向中性粒细胞治疗在细胞实验及动物模型中都证实了较好的疗效并取得了重要突破，有望成为未来PH治疗的新靶点。