基于肠干细胞治疗脓毒症肠屏障功能障碍的研究进展

梁 群 贾 璇 潘 郭海容 田 圆 王瀚黎

脓毒症是由于感染引起宿主免疫失调反应而导致脏器功能衰竭的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),亦是引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS) 的主要原因。 每年罹患脓毒症的患者为(1900 ～4890)万,发生率和病死率持续上涨,约占全球死亡人数的20%,是全球性的健康危机[1]。 长期以来,肠道一直被认为是脓毒症MODS 的发动机,肠道受损后,内毒素从肠内转移到循环中,加重脓毒症[2,3]。 因此,探究脓毒症相关肠功能损伤机制及基于肠干细胞(intestinal stem cell,ISCs)治疗脓毒症肠屏障功能障碍(intestine barrier functional disturbance,IBFD)的方法,对提高脓毒症患者治愈率及改善预后生存质量具有现实意义。

正常肠黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障、生物屏障构成,对维持机体正常运转起重要作用。脓毒症导致肠黏膜屏障结构发生一系列病理生理变化：肠内稳态破坏,分泌产生肠道蛋白水解酶,肠微生物群组成改变,上皮通透性增加,黏膜机械、化学屏障功能受损,肠内毒素穿过肠屏障到达其他无菌器官定植、过度生长,生物屏障结构改变,引发感染,破坏免疫屏障,出现SIRS、MODS,危及患者生命。

一、肠干细胞概述

肠干细胞(intestinal stem cell,ISCs)是一种未分化且具有高核质比的隐窝底部柱状细胞(crypt base columnar cells,CBC),因其具有增殖、再生、转化为分化细胞和产生组织的能力一直备受关注。 干细胞区域的组成包括：位于隐窝底部+1 ～+3 位置、 +4 位置的CBC 以及潘氏(Paneth)细胞[4]。 +4 位置的细胞长时间呈现类静止状态,作为功能性干细胞贮备库,在组织损伤或CBC 缺失情况下激活其“干性”,再次进入分裂状态;Paneth 细胞通过维持ISCs 生态位影响其增殖、分化[5]。 Paneth 细胞和+4 位置CBC 共同维持ISCs 动态平衡。

根据特性可将ISCs 分为两大群体：活跃增殖的aISC(actively proliferating intestinal stem cell)和缓慢增殖的储备rISC(reserve or more quiescent intestinal stem cell)[6]。 有实验表明,肠道周转率很大程度上取决于ISCs 的自我更新,即细胞在活跃循环和静止表型之间的转换,aISC 介导正常情况下的肠上皮更新,rISC 在组织损伤时完成特定再生任务[7]。

ISCs 具有两个显著特点,一是产生多谱系分化的子代细胞,二是长期保持自我更新。 ISCs 产生一个高度增殖的转扩细胞池,细胞向上迁移到绒毛,并分化为两个主要的细胞谱系,用于吸收食物的吸收系细胞和用于分泌激素的分泌系细胞[8]。 正常情况下,肠上皮细胞通过ISCs 分化的子代细胞,每3 ～5天更新一次;当肠道受损时,即使ISCs 数量减少,若Paneth 细胞和+4 位置CBC 受损相对较轻,依然能够恢复肠道功能,维持肠道内稳态。 在修复肠上皮的过程中,Paneth 细胞通过Wnt 配体与Frizzled 受体及其共受体复合物低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 结合,与T 淋巴细胞因子相互作用,识别下游的靶基因,激活rISC,使其“休眠”状态转为活跃状态,加速修复肠上皮黏膜,通过恢复上皮细胞更新,完成ISCs 生态位重建[9]。 与此同时,Notch 信号对肠道祖细胞的增殖和分化有调节功能,通过作用于olfactomedin4 基因,抑制转录因子Atoh1 表达,引导祖细胞分化,增加其数量,达到满足ISCs 增殖的目的[10]。

在ISCs 增殖、分化和凋亡的过程中,受到肠道多重信号的影响,依赖于不同信号途径的相互作用,以维持ISCs 的稳态,各通路交织成为信号通路网,调控ISCs 的增殖和分化,使肠道内各细胞群处于稳定状态。

二、脓毒症相关肠屏障功能障碍

脓毒症对相关肠屏障功能障碍(intestine barrier functional disturbance,IBFD)的影响主要包括两个方面,其一是脓毒症引起细胞凋亡、坏死,最终导致肠缺血,诱发坏死性IBDF;其二是感染造成的炎性反应损伤黏膜上皮,增加肠黏膜通透性,造成持续进行性IBDF。

1.坏死性IBDF：脓毒症对肠屏障功能损伤分3个阶段推进。 第1 阶段损伤是内脏灌注不足或缺血;第2 阶段损伤是复苏期间肠血流的恢复,导致缺血-再灌注损伤;第3 阶段损伤是肠屏障功能的丧失,出现肠系膜微循环障碍,造成坏死性损伤。 脓毒症主要病理机制是“招募”炎性细胞,产生过度促炎反应[11]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖以及损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),包括线粒体DNA、高流动性组蛋白B1 和血清淀粉样蛋白A 等,导致肠内皮黏附因子水平随中性粒细胞和巨噬细胞增加而上调,这些一线防御细胞在肠道中产生大量促炎性细胞因子,引发炎性反应,引起细胞大量凋亡和坏死,导致肠道血液灌注不足及回流障碍,引起肠缺血性损伤[12]。 肠道局部缺血早期始于表层,后向肠壁深部发展,肠系膜血流量突然减少或中断,破坏肠内动态平衡,近端循环中内脏血流量的减少导致深度缺血,甚至诱发肠局部坏死,形成不可逆的缺血性IBDF。

2.进行性IBDF：病原相关分子入血后,启动病原相关分子模式,脂多糖结合蛋白识别LPS,并与Toll样受体4(TLR4)结合,活化NF-κB、MAPK 信号通路,引起级联反应,释放大量的炎性介质,发生炎性反应[13]。 重症患者机体防御系统本就脆弱,在这种情况下,机体防御系统“重新编程”,既无法消除原发感染,也无法防止继发感染[14]。 凋亡和坏死机制损害黏膜上皮,导致DAMPs 进一步释放,这种恶性循环延续到后续的炎性反应中,导致溃疡和出血增加,使黏膜稳态失衡加剧[15]。 黏膜稳态失衡,异常激活肠道免疫细胞,改变控制细胞间紧密连接的调节因子[16]。脓毒症大鼠模型中,可以观察到紧密连接蛋白和封闭蛋白claudin-1、3、4、5 和8 重新排布,肠上皮内紧密连接蛋白和内皮屏障功能调节因子zonulin-1 超微结构中断,肠道通透性增加,肠内相关致病因子大量易位,由此产生促炎性细胞因子,发生局部肠道炎性反应[17]。 微循环再灌注恢复后,肠道内DAMPs 首先被吸收到肠系膜淋巴系统,经由肠系膜淋巴管排入乳糜池,在左锁骨下静脉进入体循环[18]。 肺动脉是DAMPs 经由肠系膜淋巴管到达的第一个血管,因此,肺也是脓毒症患者最常见的受累器官;DAMPs 进入体循环后,全身细胞-趋化因子反应的过度释放,造成急性肾损伤;线粒体功能障碍及内质网应激导致肝衰竭[19]。 由此,脓毒症造成持续进行性IBDF 的同时,也伴随各器官的急性损伤,造成MODS 甚至多器官功能衰竭,反向加速脓毒症进展[20,21]。

三、脓毒症对ISCs、IBFD 影响及相关治疗

脓毒症对ISCs 及IBFD 影响主要涵盖两个基础点：炎性细胞因子通过信号通路影响ISCs 活性,降低其修复黏膜损伤速度;灌注不足造成肠缺血性损伤影响ISCs 数量,加重黏膜损伤程度。 因此,可以基于以上两点探究脓毒症相关IBFD 的ISCs 靶向治疗模式。

1.炎性细胞因子影响ISCs 活性：炎性细胞因子通过信号通路影响ISCs 活性。 PI3K/Akt 通路是一个信号转导酶家族,可调节细胞增殖和存活率,在炎性反应中发挥着负性调节作用;Hippo 通路对于调控组织器官的大小和生长至关重要,YAP 蛋白作为Hippo通路中的核心因子,控制生物器官发育和调控细胞生长[22,23]。

脓毒症期间,肠道中内毒素刺激PI3K/Akt 通路,诱导产生三磷酸磷脂酰肌醇,Hippo/YAP 信号通路活性被其抑制,当Hippo 信号失活时,LATS1/2 激酶失活,YAP 蛋白不能被磷酸化,YAP 蛋白转移进入细胞核,结合调控转录靶基因的表达,降低ISCs 增殖分化速度,导致黏膜修复速度减缓,加重肠道受损程度、加剧脓毒症病情发展[24]。

同时,炎性细胞因子通过改变ISCs 对称分裂模式影响其活性[25]。 ISCs 在争夺生态位空间、加速增殖分化时主要发生对称分裂,脓毒症期间,肠黏膜上皮细胞被破坏,大量炎性细胞因子诱导ISCs 发生不对称分裂,导致分裂模式紊乱,生成分化潜能低、甚至无分化能力的无效子细胞,具有“干性”的ISCs 数量减少,延缓上皮黏膜修复速度,加速病情恶化。

2.灌注不足造成肠缺血性损伤影响ISCs 数量：随着缺血时间延长,进行性上皮损伤逐渐向隐窝延伸。 短暂缺血1 ～2h 后,再灌注加剧上皮损伤;缺血3h 后,隐窝组织学损伤逐渐明显,ISCs 数量有所减少,绒毛上皮完全丧失;缺血持续4h 后,隐窝上皮近乎完全丢失,隐窝上皮细胞的数量明显减少[26,27]。脓毒症造成肠缺血性损伤通常大于4h,对隐窝的严重损伤已经形成,ISCs 数量锐减,无法进行有效的增殖分化。 脓毒症期间,肠道组织严重缺氧,上皮细胞中的细胞外泌体微RNA-34a 增加,加速ISCs 不对称分裂,使具有“干性”的ISCs 数量快速减少,ISCs 自我更新和分化能力减弱,无法及时替代凋亡的肠黏膜上皮细胞,屏障功能得不到修复,相关IBFD 加剧。

3.基于ISCs 的治疗：ISCs 移植是重建IBFD 患者上皮屏障的一种新型治疗方法。 有实验表明,ISCs可以进行体外类器官培养,与活体中的肠上皮相似,类器官同样拥有隐窝、绒毛区及由ISCs 增殖分化的各类上皮细胞[28,29]。 为降低组织排斥风险,可以通过内镜活检从IBFD 患者的健康肠组织中收集ISCs,同时筛查与脓毒症相关的突变基因,降低移植后肠道恶化风险,用建立的类器官培养法进行体外扩增,培养到所需数量的细胞后,通过内镜移植到目标部位。 后期通过评估证实,与患者器官样培养基比较,类器官簇状、杯状细胞表达率更高,最新的临床评估认为,这种治疗方法值得深入研究并大规模推广[30]。

四、展 望

肠道被认为是系统性炎性反应的来源和MODS的“引擎”,对肠屏障功能的病理生理学解释还在随着时间而不断更迭。 肠道作为脓毒症患者最先出现相应临床症状的器官,肠黏膜上皮损伤导致IBDF,从局部微循环障碍发展为全身炎性反应、免疫抑制,最终导致机体出现MODS。 近年来,随着对脓毒症IBDF 的深入理解,治疗重点已从单纯的抗炎抗感染转至修复肠黏膜细胞、纠正黏膜功能障碍的多靶点治疗,人们越来越需要找到安全、可行的方式,以恢复或预防脓毒症患者出现IBFD。

综上所述,ISCs 是参与IBFD 应答的主要靶细胞之一,不仅是肠道炎性反应中被动的靶细胞,也是一种效应细胞;不单具有修复受损肠黏膜、改善肠道缺血、保护肠组织的作用,在严重感染反应造成的IBDF中,还能起到调节内皮细胞功能等保护机制。 故而,靶向ISCs 治疗将从根本上调整脓毒症患者相关IBFD 的治疗策略,大幅度提高脓毒症患者复苏成功率,最终降低脓毒症、脓毒性休克及MODS 的病死率,改善预后生存质量。 因此,基于ISCs 疗法的研究有望成为医学、药学和生命科学等的前沿领域。