重楼2种基原植物不同部位中9个皂苷含量比较△

王旭星，贾天颖，杨成金，文佳，徐新房，苏钛，叶先文，程水清，王璇，李向日*

1.北京中医药大学 中药炮制研究中心/中药品质评价北京重点实验室，北京 102488；

2.北京同仁堂股份有限公司 同仁堂制药厂，北京 102629；

3.云南白药集团中药资源有限公司，云南 昆明 650500

重楼又名金钱重楼、白甘遂、草河车、蚤休[1]，为百合科植物云南重楼Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz 或七叶一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara 的干燥根茎[2]，主产于云南、贵州、四川等西南各省[3]。其味微苦，性寒，有小毒，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效[2]。重楼的化学成分复杂，主要包括甾体皂苷、蜕皮激素、萜等类成分。其中主要的药效成分为甾体皂苷类成分[4]，此类化合物的苷元母核由6 个环组成，根据其结构可以分为薯蓣皂苷和偏诺皂苷2 类，两者的区别在于母核C-17 位是否有含氧取代（偏诺皂苷有取代）[5]。重楼属植物中的大部分皂苷是由这2 种皂苷元通过羟化、脱水、苷化形成[6]。现代药理研究表明，重楼有较好的抗炎[7]、抗肿瘤[8]、止血[9]、抗氧化[10]、促进子宫收缩[11]等药理作用，其中薯蓣皂苷的抗肿瘤作用强于偏诺皂苷，而止血作用弱于偏诺皂苷[12]。

重楼基原植物生长周期长，其种子具有“二次休眠”的特性，需要经历形态成熟和生理成熟2 个阶段，至少2 年才能萌发，而且种子成熟后还容易发生霉变、腐烂现象[13]，正常生长的情况下，从栽种至其成熟需要8～10 年[14]。再加上其药用价值大、市场需求量高等原因，导致野生重楼资源迅速减少，市场上以假充真、以劣充优现象严重[15]。对重楼基原植物不同部位的充分利用是解决资源浪费问题和减少市场乱象的有效手段。

目前已有针对重楼地上部分的研究。陈昌祥等[16]研究表明，云南重楼地上部分茎叶中含有11 个与地下根茎相同的甾体皂苷类成分，由此可见重楼地上部分可以作为单一成分提取的原料而得到充分利用。唐娜等[17]从北重楼P.verticillataM.Bieb.根中分离出了2个甾体皂苷和4个甾酮类化合物。本研究采用实验室前期建立的方法对重楼2个基原植物3个部位（根茎、须根和芽）中9 个甾体皂苷类成分含量进行比较，以期探究重楼不同基原、不同部位中重楼皂苷含量的差异，为重楼药材资源的充分利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪（2489 型紫外检测器，Empower 色谱工作站）；KQ-500DE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA-1004 型电子分析天平（上海天平仪器厂）；PL2002 型电子天平（梅特勒-托科多仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品重楼皂苷Ⅰ（批号：111590-201604，纯度：93.6%）、重楼皂苷Ⅱ（批号：111591-201604，纯度：91.4%）、重楼皂苷Ⅵ（批号：111592-201604，纯度：97.0%）、重楼皂苷Ⅶ（批号：111593-201604，纯度：94.0%）、重楼皂苷Ⅳ（批号：111707-201703，纯度：96.1%）均购于中国食品药品检定研究院；对照品重楼皂苷Ⅲ（批号：CF0227QC14，纯度：98%）、重楼皂苷Ⅴ（批号：Y19F7H9835，纯度：98%）、重楼皂苷H（批号：C12A8G33615，纯度：98%）均购于上海源叶生物科技有限公司；对照品重楼皂苷D（批号：16063003，纯度：97%）购于成都普菲德生物科技有限公司；色谱级乙腈（Fisher 公司）；实验用水为娃哈哈纯净水。

野外采集新鲜云南重楼药材8 批、七叶一枝花药材7 批，经中国科学院昆明植物研究所李恒研究员鉴定分别为百合科植物云南重楼Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz 和七叶一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara，将药材不同部位进行分离，标本藏于云南省药物研究所。不同部位样品信息见表1，典型图片见图1。

图1 重楼药材不同部位样品（DCL-01-024）

表1 云南重楼和七叶一枝花样品信息

2 方法

2.1 色谱条件

十八烷基硅烷键合硅胶SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～30 min，15%～30%A；30～35 min，30%A；35～48 min，30%～43%A；48～53 min，43%A；53～60 min，43%～50%A；60～65 min，50%A；65～75 min；50%～60%A）；柱温为30 ℃；进样量为10 µL；流速为1.1 mL·min-1，检测波长为203 nm。

2.2 对照品溶液的制备

分别取对照品重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D 和重楼皂苷H 适量，精密称定，加甲醇制成含9 个皂苷分别为2.104、1.984、2.172、3.084、0.354、1.988、2.112、0.370、1.640 mg·mL-1的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取上述重楼样品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声提取（500 W，40 kHz）2 次，每次30 min，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，滤过，合并溶液置于100 mL 旋蒸瓶中，在40 ℃旋干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 样品测定

含量测定方法采用课题组前期建立的方法[18]，已进行提取工艺和方法学研究，结果均符合规定，色谱图见图2。重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ的分离度分别为4.38、2.00、2.36、2.89、5.55、3.21、1.83、1.64、5.37，达到了定量要求。

图2 重楼中9个皂苷HPLC图

2.5 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件对成分之间的相关性进行分析。采用SIMCA 13.0软件对重楼药材不同基原不同部位的9个重楼皂苷含量进行主成分分析（PCA）；采 用Origin 9.8 插 件Heat Map Dendrogram 对9 个重楼皂苷含量进行聚类分析。

3 结果与分析

3.1 含量测定

重楼2 种基原3 个部位中9 个重楼皂苷含量测定结果见表2，对含量测定结果进行综合分析见表3。

表2 重楼中9个皂苷成分质量分数（n=4）

表3 重楼2种基原、3个不同部位中9个重楼皂苷质量分数（,n=6）

表3 重楼2种基原、3个不同部位中9个重楼皂苷质量分数（,n=6）

注：DG.云南重楼根茎；QG.七叶一枝花根茎；DX.云南重楼须根；QX.七叶一枝花须根；DY.云南重楼芽；QY.七叶一枝花芽；同一基原的须根和芽与根茎比较，*P＜0.05；不同基原的同一部位比较，#P＜0.05；—表示未检出。

重楼皂苷的含量受环境影响较大，相同基原和部位不同批次重楼的皂苷含量存在着较大的个体差异。云南重楼根茎中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ和重楼皂苷Ⅳ的含量均显著高于七叶一枝花根茎，重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D 和重楼皂苷H 的含量低于七叶一枝花根茎；云南重楼须根中重楼皂苷Ⅶ的含量显著高于七叶一枝花须根；云南重楼芽中重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷D 和重楼皂苷H 的含量显著低于七叶一枝花芽。通过比较相同基原重楼的不同部位9个皂苷含量可以发现，云南重楼须根中重楼皂苷I、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅴ的含量比根茎和芽中高，其余皂苷都比这2 个部位高；七叶一枝花的3 个部位中，皂苷含量整体上表现出芽最高，须根最低。综合来看，9 个重楼皂苷的含量在不同基原和不同部位中均表现出较大差异，这提示临床将不同基原的重楼分开使用及净制去除须根和芽具有必要性。

9 个皂苷的结构存在差异，根据苷元C-17 位是否有含氧取代可以分为两大类，即薯蓣皂苷和偏诺皂苷，这两大类皂苷的糖基部分主要由鼠李糖基、葡萄糖基和阿拉伯糖基组成，两者的皂苷元结构和具体糖链信息分别见图3和表4。在生物合成上，先合成薯蓣皂苷元，然后糖苷化生成各种薯蓣皂苷，或者经过羟化生成偏诺皂苷元，再苷化生成各种偏诺皂苷。对9 个皂苷的含量进行相关性分析，结果见表5，重楼皂苷Ⅰ与其余4种薯蓣皂苷存在着显著的正相关性，与重楼皂苷Ⅶ存在着显著的负相关性。除此之外，重楼皂苷Ⅱ与重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅶ，重楼皂苷Ⅲ与重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅶ，重楼皂苷Ⅳ与重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H，重楼皂苷Ⅴ与重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷D、重楼皂苷H，重楼皂苷Ⅵ与重楼皂苷D、重楼皂苷H，重楼皂苷Ⅶ与重楼皂苷H，重楼皂苷D与重楼皂苷H 均具有显著的相关性。说明不同皂苷之间可能存在着转化关系，在重楼药材生长过程中，受不同光照、温度和湿度等的影响，其转化方向可能存在差异，同种基原和部位不同批次的重楼皂苷含量也存在着较大个体差异。

表4 重楼皂苷糖链结构

表5 重楼样品中不同皂苷含量的相关系数

图3 薯蓣皂苷元与偏诺皂苷元结构

由于薯蓣皂苷和偏诺皂苷的药理作用存在差异，因此重点对2种基原重楼3个部位的薯蓣皂苷和偏诺皂苷类成分进行统计分析，结果见图4。同种部位不同基原比较结果表明，云南重楼根茎中的薯蓣皂苷含量显著高于七叶一枝花根茎，而偏诺皂苷含量显著低于七叶一枝花根茎；2 种基原重楼须根中薯蓣皂苷和偏诺皂苷含量差异均无统计学意义；云南重楼芽中2 类皂苷含量均低于七叶一枝花。同一基原不同部位比较结果表明，云南重楼须根中薯蓣皂苷含量显著低于根茎，而偏诺皂苷含量显著高于根茎；七叶一枝花须根中偏诺皂苷含量显著低于根茎，而薯蓣皂苷含量差异无统计学意义；七叶一枝花芽的薯蓣皂苷含量显著高于根茎，而偏诺皂苷含量显著低于根茎。综合来看，重楼不同基原、不同部位的薯蓣皂苷与偏诺皂苷差异均有统计学意义，在临床使用时应根据具体的情况将来源不同的重楼根茎应用于不同的病症，在制剂提取时可将不同部位当作提取薯蓣皂苷或偏诺皂苷的原料。

图4 云南重楼和七叶一枝花不同部位薯蓣皂苷和偏诺皂苷含量比较（,n=6）

3.2 重楼不同基原、部位皂苷含量聚类分析

对2 种基原重楼3 个部位9 个皂苷的含量进行聚类分析（图5）。结果表明，2个基原重楼药材的3个部位物质基础存在差异，根据聚类结果可以将不同基原重楼药材不同部位大致分为三大类，其中云南重楼根茎与云南重楼芽为一类，七叶一枝花芽为一类，2 种基原重楼的须根和七叶一枝花的根茎分为一类。对不同皂苷进行聚类可以将9 个皂苷分为3类，第1类是重楼皂苷Ⅱ，属于薯蓣皂苷，第2类是重楼皂苷Ⅶ，属于偏诺皂苷，其他7 个皂苷为第3类。综合来看，云南重楼根茎中的薯蓣皂苷类成分主要是重楼皂苷Ⅱ，七叶一枝花根茎中的偏诺皂苷类成分主要是重楼皂苷Ⅶ，可以考虑以重楼皂苷Ⅱ来代表云南重楼根茎薯蓣皂苷含量水平，以重楼皂苷Ⅶ来代表七叶一枝花根茎偏诺皂苷含量水平。

图5 不同基原重楼、不同部位与9个甾体皂苷含量聚类分析热图

对2 种基原重楼3 个部位中9 个重楼皂苷含量进行PCA，所得得分图及载荷图见图6，通过降维处理之后，可以看出不同基原的重楼根茎、芽之间具有一定的差异，同种基原非药用部位和药用部位之间的皂苷含量存在差异；结合2 类皂苷含量及药理活性的差异，可以考虑将2 种基原的重楼分开使用，并且用的时候应去除非药用部位，但仍需更多的药效学研究和更多批次样品数据的支撑。以9 个重楼皂苷含量为参数分别对云南重楼和七叶一枝花的根茎、须根和芽做PCA，得到其载荷图见图6B，各类重楼皂苷在区分重楼2种基原、3个部位时均具有较强的贡献度，其中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ在区别云南重楼根茎和其他基原、部位时可作为质量标志物，重楼皂苷Ⅶ在区分七叶一枝花根茎和其他基原、部位时可作为质量标志物。

图6 2种重楼基原、3个部位与皂苷含量PCA得分及载荷图

4 讨论

本研究运用HPLC同时测定了2种基原重楼药材3个部位中9个重楼皂苷的含量，通过对实验结果分析发现，不同基原和不同部位的9 个重楼皂苷含量差异较大，同一基原同一部位受产地或年限等影响，皂苷含量也表现出较大差异。由于这种客观的差异性及9 个皂苷之间存在的相互转化关系，难以对不同基原和不同部位的单个皂苷含量进行统计学分析且缺乏实际应用价值，因此本研究着重对两大类药理作用不同的重楼皂苷（薯蓣皂苷和偏诺皂苷）含量进行综合分析。结果发现，云南重楼和七叶一枝花的2 类皂苷差异有统计学意义，云南重楼根茎中含有的以抗肿瘤为主要作用的薯蓣皂苷含量显著高于七叶一枝花根茎，七叶一枝花根茎中含有的以止血为主要作用的偏诺皂苷含量显著高于云南重楼根茎。因此，以止血功效为主的中成药，如云南红药胶囊和宫血宁胶囊等，宜选用七叶一枝花入药，而以抗肿瘤为主要功效的中成药，如肝复乐片等，更宜选用云南重楼入药。但在选择基原时，还要综合考虑各基原的资源分布等情况。

由于重楼药材在采挖过程中会带有须根和芽，在临床上煎煮使用时，须根过滤不干净可能会引起喉头呛咳水肿，因此传统的净制要求去除须根和芽。鉴于野生重楼资源的珍贵和稀少，本研究通过对须根和芽的皂苷含量进行测定以探讨重楼非药用部位的药用价值。结果发现，须根和芽的重楼皂苷含量与根茎有较大的差异，其存在会影响药用部位中皂苷的含量及皂苷之间的比例关系，因此从含量上分析，净制去除须根和芽具有一定的科学道理。除此之外还发现，七叶一枝花芽中的薯蓣皂苷和偏诺皂苷均显著高于云南重楼芽，说明七叶一枝花芽作为单一皂苷或某类皂苷提取原料具有较高使用价值。两者的须根差异无统计学意义，但两者所含偏诺皂苷含量显著高于薯蓣皂苷含量，作为偏诺皂苷的提取原料具有较高使用价值。

另外，鉴于重楼皂苷标准品价格昂贵，考虑到重楼皂苷Ⅱ在各个部位中含量都较高，而且分离度较好，因此在实验室前期研究[18]中，以重楼皂苷Ⅱ为参照计算了重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ的相对校正因子，分别为1.01、0.67、1.11、1.37、1.00、1.19、1.08、1.21、1.28，相对保留时间分别为0.73、0.75、0.76、0.79、1.00、1.03、1.04、1.06、1.11，可为采用一测多评法计算9 种甾体皂苷的含量提供参考。

虽然重楼皂苷的含量受环境影响较大、组内差异显著，但是本研究通过聚类分析和PCA 发现不同基原不同部位的物质基础存在规律性差异，不仅发现了2 种基原重楼药用部位之间的差异，为临床合理应用提供了初步的思考，也发现了非药用部位的使用价值，为重楼资源的充分开发使用提供参考。