柱前衍生化高效液相色谱法测定麦冬中多糖的含量

孙红梅，李明华，程显隆，魏锋*，马双成，杨秀伟

1.无限极（中国）有限公司，广东 江门 529100；

2.北京大学 前沿交叉学科研究院，北京 100871；

3.中国食品药品检定研究院，北京 100050；

4.北京大学 药学院 天然药物学系/天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191

麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥块根，具有养阴生津、润肺清心之功效，可用于肺燥干咳、阴虚痨嗽、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘[1]。麦冬含有甾体皂苷、高异黄酮、糖类、挥发油和微量元素等有效化学成分[2]，其中多糖类成分具有降血糖[3-9]、调节免疫力[3,6,9-11]、抗氧化[3,6,9,12-13]、平喘、抗过敏[6,9]、抗心肌缺血[2-3,6,9]、解酒保肝[14]等药理作用。目前多糖分析方法主要有比色法[15-19]、高效液相色谱-蒸发光散射法[20-23]、气相色谱法[24]、离子色谱法[25]等，未有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色谱法对麦冬中多糖单糖的组成研究。比色法受中药中成分复杂、干扰因素不易排除、成分含量变化幅度大等因素影响，重现性较差。高效液相色谱-蒸发光散射法对色谱柱要求较高，容易基线漂移，色谱柱易出现化学降解现象，且检测器价格昂贵，难以普及[26]。气相色谱法对单糖测定时容易出现色谱峰异构化裂分，对糖醛酸和氨基糖的分析不太适合[26]。离子色谱法灵敏度较高，但是糖类在电极表面能将某些分子氧化或还原，并且易受环境温度的影响，从而影响方法的准确性[24]。PMP 柱前衍生化高效液相色谱法首先是将多糖提取液进行水解，其次用PMP 衍生化试剂对水解液中单糖进行衍生化，形成具有紫外吸收的衍生化产物，最后采用高效液相色谱-紫外检测法进行测定[26-29]，此方法相对上述各方法灵敏度高[28]、准确度高、操作简便。本研究采用PMP 柱前衍生化高效液相色谱法对麦冬中多糖水解液中主要单糖的组成及含量进行研究，为麦冬的质量控制研究提供参考。

1 材料

1.1 试药

PMP（批号：G1780030，纯度：98.0%，上海安谱实验科技股份有限公司）；标准品来苏糖（批号：K08D8B48856，纯度：98%，上海源叶生物有限公司）；标准品甘露糖（批号：140651-201805，纯度：100.0%）、鼠李糖（批号：111683-201502，纯度：100%）、半乳糖醛酸（批号：111646-201702，纯度：95.1%）、无水葡萄糖（批号：110833-201908，纯度：99.8%）、半乳糖（批号：100226-201807，纯度：100.0%）、阿拉伯糖（批号：1506-200202）均购自中国食品药品检定研究院；无水乙醇（批号：20200804）、氢氧化钠（批号：20180615）、盐酸（批号：20150930）均购自国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸（批号：G2200020）、磷酸二氢钾（批号：G7920020）均购自上海安谱实验科技股份有限公司；水为纯净水。

11 批麦冬药材均购自于市场，样品信息见表1，经中国食品药品检定研究院中药材室魏锋研究员鉴定为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥块根。

表1 麦冬样品信息

1.2 仪器

e2695 型高效液相色谱仪（Waters 公司）；LC-2010A 型高效液相色谱仪（岛津公司）；Biofuge Primor 型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；ME155DU 型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；TTL-DC 型氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；DGG-9030A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；FE-500 型再循环冷却器（Julobo 公司）；DZTW 调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；Milli-Q 型超纯水系统（Millipore公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters Symmetry-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.8）（16∶84）为流动相，等度洗脱；检测波长为250 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样体积10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 衍生化试剂的制备 取PMP 对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成0.3 mol·L-1的溶液，即得[29]。

2.2.2 内标溶液的制备 取来苏糖标准品适量，精密称定，加水溶解制成0.2 mg·mL-1的溶液，即得[29]。

2.2.3 对照品溶液的制备 取甘露糖、葡萄糖和半乳糖标准品适量，精密称定，加水分别制成含甘露糖0.3 mg·mL-1、葡萄糖2.0 mg·mL-1和半乳 糖1.0 mg·mL-1的混合溶液。精密吸取该混合溶液0.125 mL，加内标溶液0.125 mL、0.3 mol·L-1氢氧化钠溶液0.300 mL、衍生化试剂0.500 mL，密封，70 ℃加热30 min，冷却，再加0.3 mol·L-1盐酸0.300 mL和水0.650 mL，摇匀，滤过，即得。

2.2.4 供试品溶液的制备 取样品粉末（过三号筛）约2.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150 mL，加热回流1 h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，精密加水100 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，转移至离心管中，离心（转速8000 r·min-1，离心半径为12 cm）20 min。精密吸取上清液2.5 mL，置20 mL顶空瓶中，加6 mol·L-1三氟乙酸溶液0.5 mL，密封，110 ℃水解3 h，冷却，氮吹仪吹干，残渣加0.125 mL水溶解。加内标溶液0.125 mL、0.3 mol·L-1氢氧化钠溶液0.300 mL、衍生化试剂0.500 mL，密封，70 ℃加热30 min，冷却，再加0.3 mol·L-1盐酸0.300 mL和水0.650 mL，摇匀，滤过，即得。

2.3 专属性试验

取2.2 项下供试品溶液、混合对照品溶液、空白溶液、供试品溶液（未加内标）和空白溶液（未加内标）各10 μL，进样测定。在2.1 项下色谱条件，甘露糖、葡萄糖和半乳糖衍生物的色谱峰可达到基线分离，且达到定量限要求，样品中的其他成分对单糖组分的检测无干扰，各成分分离度＞1.5，结果见图1。理论板数按葡萄糖色谱峰计算不低于8000。

图1 空白溶液、混合对照品溶液和麦冬样品溶液高效液相色谱图

2.4 线性方程

精密称定甘露糖9.37 mg、葡萄糖60.83 mg、半乳糖30.44 mg，置于10 mL 量瓶中，加水溶解、定容并混匀。将上述溶液加水逐级稀释成7 个质量浓度的混合对照品溶液，按2.2.3 项下方法制备对照品溶液，在2.1 项下条件进样测定。以各组分质量浓度为横坐标（X），色谱峰峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。回归曲线及线性范围见表2。

表2 麦冬多糖中3个单糖测定标准曲线

2.5 精密度试验

取同一质量浓度混合对照品溶液，重复进样6次，测得甘露糖、葡萄糖、半乳糖峰面积的RSD 分别为0.8%、1.5%、1.2%，保留时间的RSD 分别为0%、0.1%、0.1%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取S1样品，以2.2.4项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、6、10、16、20、24 h进样，测定，以7 次进样所测得的单糖峰面积与内标峰面积比值为考察指标，计算RSD。结果甘露糖、葡萄糖和半乳糖峰面积与内标峰面积比值平均值分别为0.10、0.24 和0.28，RSD 分别为1.4%、0.6%和3.0%，表明24 h内供试品溶液稳定性较好。

2.7 重复性试验

分别精密称取同一批样品（S5），6 份，按2.2.4 项下方法制备成供试品溶液，分别进样，测定，并计算各样品中单糖含量及RSD。结果麦冬中甘露糖、葡萄糖和半乳糖平均质量分数分别为0.11%、0.62%和0.21%，RSD分别为2.6%、3.6%和3.5%，表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

分别精密称取甘露糖、葡萄糖和半乳糖对照品适量，加水溶解，制成质量浓度分别为0.012 6、0.058 1、0.027 5 mg·mL-1的混合对照品溶液。取6份麦冬样品（S5）各1 g，精密称定，按2.2.4 项下方法，操作至“将残渣及滤纸置烧瓶中”，分别精密加上述混合对照品溶液100 mL，称定质量，自“加热回流1 h”起，按2.2.4 项下方法操作，制成供试品溶液，进样，测定，并计算加样回收率。结果见表3。表明加样回收率试验良好。

表3 麦冬中各单糖的回收率试验结果

2.9 样品含量测定

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。按公式（1）分别计算衍生化单糖在麦冬样品中的含量。以甘露糖、葡萄糖和半乳糖百分比的总和计算麦冬中多糖的含量。

单糖质量分数=（RU/RS）×AS×（F/W）×100%(1)

式中RU为供试品溶液中相关分析物与内标物的峰面积比；RS为对照品溶液中相关分析物与内标物的峰面积比；AS为衍生化标准溶液中相关分析物的质量（mg）；F为稀释因子；W为所称取的药材质量（mg）[29]。

11 批麦冬样品多糖含量测定结果见表4，麦冬总多糖平均质量分数为1.46%。

表4 麦冬中单糖及总多糖含量测定结果（n=2）

3 讨论

本研究分别考察80%乙醇提取体积（150、200、250 mL）和提取时间（1、2、3 h），水提取体积（50、100 mL）和提取时间（1、2、3 h）对麦冬中多糖含量的影响，结果80%乙醇150 mL，提取时间1 h，水100 mL，提取时间1 h 时麦冬中多糖的含量最高。酸解条件及衍生化条件参考本课题组前期研究成果[29]。色谱柱考察了Waters Symmetry C18、Welch Ultimate XB-C18和Agilent TC-C18，规格均为（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温考察了25、30、35 ℃，流速考察了0.8、1.0、1.2 mL·min-1，结果显示，不同品牌和型号的色谱柱、不同柱温和不同流速对保留时间具有显著的影响，对理论板数和分离度影响均不明显。

虽然有文献报道麦冬多糖的主要单糖成分为果糖和葡萄糖[22]，同时PMP 作为一种可以在强碱性的氢氧化钠条件下与醛单糖反应的通用化学修饰试剂，无法修饰酮单糖（果糖）[30]，但是本研究以麦冬中多糖水解液中部分单糖即甘露糖、葡萄糖和半乳糖之和计多糖含量，既节省检测成本又对麦冬中多糖的含量起到一定的控制作用。

马定远等[27]发现环境温度对结果的影响很大，因此，样品测定需随行标准品对照，可避免因样品衍生化过程中温度变化对测定结果的影响。相对于外标法，测定结果更准确，重现性较好。本研究采用麦冬中不含有的来苏糖作为内标物分别测定甘露糖、葡萄糖和半乳糖的含量，并以其总和计麦冬中多糖的含量，操作简便、快捷，准确度高，重复性良好，可用于麦冬中多糖的含量测定，为其他药材及饮片中多糖的测定提供参考。