海口市儿童肺炎患者呼吸道标本流感嗜血杆菌的耐药性与分子流行病学特征

麦文慧，尹飞飞，卓珠琳，郑 青，陈柳虹

(1. 海口市妇幼保健院检验科，海南 海口 570203； 2. 海南医学院-香港大学热带传染病联合实验室，海南 海口 571199； 3. 海口市第三人民医院检验科，海南 海口 571100)

流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)主要定植在咽喉及口腔黏膜，当机体免疫功能低下时，可引起急性咽炎、喉炎、气管炎、肺炎、中耳炎、鼻窦炎、心内膜炎、败血症、脑膜炎等急性化脓感染及严重的继发感染[1]。流感嗜血杆菌是引起儿童呼吸道感染的主要病原菌，其感染人群、流行季节、耐药性等均呈现地域性差异[2-3]。流感嗜血杆菌是海口地区引起儿童呼吸道细菌感染的首位病原体[4]，严重危害该地区儿童健康。为进一步了解海口地区儿童肺炎来源的流感嗜血杆菌临床特征、耐药性，以及其群体结构、克隆在社区传播情况，对2021年海口市妇幼保健院住院肺炎患儿分离的流感嗜血杆菌进行研究，旨在为该地区预防和治疗儿童流感嗜血杆菌性肺炎提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2021年因肺炎在海口市妇幼保健院住院治疗的患儿为研究对象，分析患儿痰、肺泡灌洗液标本细菌培养出流感嗜血杆菌情况，剔除同一患儿同次住院重复菌株。儿童社区获得性肺炎(CAP)诊断标准参照2019年版《儿童社区获得性肺炎诊疗规范》[5]。患儿入院后24 h内通过一次性无菌吸痰管负压吸取痰标本送检，痰合格标准为：白细胞>25个/低倍视野，鳞状上皮细胞<10个/低倍视野。对于肺部感染导致的肺实变、肺不张患儿，通常进行支气管肺泡灌洗治疗，并取灌洗液送检。随机留取流感嗜血杆菌感染高发的春季中1—2月份分离的流感嗜血杆菌菌株，进行多位点序列分型(MLST)同源性检测分析。

1.2 仪器与试剂 哥伦比亚血平板、嗜血杆菌巧克力平板、MH平板购自广州迪景微生物科技有限公司，HTM平板购自郑州安图生物工程股份有限公司，细菌鉴定采用法国梅里埃VITEK 2全自动细菌鉴定分析仪及其配套的NH鉴定卡，头孢硝噻吩纸片、因子纸片购自温州康泰生物科标技有限公司，药敏纸片购自英国OXOID公司和温州康泰生物科技有限公司，标准菌株流感嗜血杆菌ATCC 49247、啮蚀艾肯菌ATCC BAA-1152、金黄色葡萄菌ATCC 29213、金黄色葡萄菌ATCC 25923、副流感嗜血杆菌等均购自温州康泰生物科技有限公司，PCR扩增仪、PCR反应试剂、电泳仪、凝胶程序成像系统、引物合成、测序等均由武汉天一华煜基因科技有限公司提供。

1.3 培养鉴定及药敏试验 标本接种于哥伦比亚血平板和嗜血杆菌巧克力平板，置5%CO2培养箱35℃培养过夜，挑取巧克力平板上湿润、透明的露滴状疑似菌落采用Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子生长需求试验进行初筛，初筛阳性菌株用梅里埃VITEK 2 Compact细菌鉴定仪及其配套的NH卡鉴定确认。挑取流感嗜血杆菌调成0.5麦氏单位菌悬液均匀涂布于HTM平板上，采用K-B纸片扩散法进行药敏试验，结果判读按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2021标准进行。采用啮蚀艾肯菌ATCC BAA-1152对NH鉴定卡进行质量控制，采用流感嗜血杆菌ATCC 49247、副流感嗜血杆菌对Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子纸片进行质量控制，采用流感嗜血杆菌ATCC 49247对HTM平板及K-B法药敏纸片进行质量控制。

1.4 β-内酰胺酶检测 采用头孢硝噻吩纸片蘸取待测菌，10 min后观察颜色变化，出现红色为阳性，即产β-内酰胺酶；1 h后无颜色变化为阴性，即不产β-内酰胺酶。采用金黄色葡萄菌ATCC 29213进行阳性质控，金黄色葡萄菌ATCC 25923进行阴性质控。

1.5 MLST (1)细菌DNA提取：采用煮沸法。吸取100 μL DNA提取液于离心管中，直接挑取流感嗜血杆菌菌落于DNA提取液中制成悬液，将离心管置于金属加热器中100℃ 10 min，再置于高速离心机12 000×g离心5 min，取上清液(即为DNA模板)4℃保存备用。(2)PCR扩增：反应总体积30 μL，包括MasterMix 15 μL，无菌水12 μL，上游引物(浓度10 mmoL)、下游引物(浓度10 mmoL)各1 μL，DNA模版1 μL。反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃末端延伸5 min。取2 μL PCR产物加2 μL 6×Loading Buffer进行电泳前处理，再取适量样品至1%琼脂糖凝胶孔中，120 V电泳20 min，采用凝胶成像分析仪进行拍照检测。见表1。(3)测序分型：将PCR产物连同相应的测序引物送Sanger测序公司进行双向测序(每个样品配5 μL上、下游测序引物，引物浓度10 μmoL)，测序平台为ABI公司的3730xl DNA Analyzer测序仪。测序结果提交MLST数据库(http://enterobase.warwick.ac.uk/species/index/mcatarrhalis)，获得各等位基因序列号并确定菌株序列型(sequence type，ST)。

表1 流感嗜血杆菌扩增/测序引物序列及产物大小Table 1 Amplification/sequencing primer sequences and product sizes of H. influenzae

1.6 统计学方法 应用WHONET 5.6软件对药敏结果进行统计处理，应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 5 342例患儿共检出流感嗜血杆菌352株，检出率为6.59%。其中男患儿检出率为7.10%，女患儿检出率为5.82%，见表2。男女患儿流感嗜血杆菌检出率比较，差异无统计学意义(P=0.066)。送检标本中，痰标本5 325份，肺泡灌洗液标本17份，分别检出流感嗜血杆菌349、3株，检出率分别为6.55%、17.65%。

2.2 不同年龄段检出情况 流感嗜血杆菌检出率以4岁～最高(12.88%)，2岁～次之(11.62%)，≥6岁为2.56%，<30 d最低(0.30%)，各年龄段比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 不同季节检出情况 流感嗜血杆菌全年均可流行，春季(1～3月)、夏季(4～6月)、秋季(7～9月)、冬季(10～12月)流感嗜血杆菌检出率分别为14.04%、4.48%、4.62%、4.40%，以春季检出率最高,见表2。不同季节检出率比较，差异有统计学意义(P<0.001)。

表2 肺炎患儿流感嗜血杆菌临床分布Table 2 Clinical distribution of H. influenzae in children with pneumonia

表3 331株流感嗜血杆菌对抗菌药物的药敏结果Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of 331 H. influenzae strains

图1 流感嗜血杆菌序列峰图Figure 1 Sequence peak of H. influenzae sequences

图2 51株流感嗜血杆菌MLST聚类树Figure 2 MLST cluster tree of 51 H. influenzae strains

3 讨论

本研究从肺炎患儿收集5 342份标本，排除咽拭子，以痰标本为主，且痰为负压吸取，减少了口咽部菌群的污染，数据更能客观反映下呼吸道感染的情况。共检出352株流感嗜血杆菌，总检出率为6.59%，肺泡灌洗液检出率为17.65%，远高于痰的6.55%，说明肺泡灌洗液对下呼吸道感染具有较高的敏感度和特异度。本研究流感嗜血杆菌总检出率比浙江嘉兴地区(3.34%)高[3]，但比浙江玉环市(11.86%)[6]、山东济南地区(12.58%)[7]、河南济源市(10.94%)均低[8]，可见不同地区的流感嗜血杆菌流行存在地域性差异。林翀等[9]报道2012年海口地区检出率为18.6%，说明同一地区不同年度流感嗜血杆菌的感染流行也不同。流感嗜血杆菌的流行不仅呈季节性分布，各地区的流行季节也不尽相同。与文献[6，10]报道的冬季检出率最高不同，海口地区春季检出率最高，冬季检出率最低，与袁文清等[11]报道一致，多个研究报道春季有较高检出率[7-8，11-12]，可能是春季冷暖交替，容易诱发流感嗜血杆菌相关呼吸道疾病，加上春季正值春节期间，人员流动性大，增加了感染风险。临床应重视春季此类疾病的防控，积极开展社区宣传工作，指导家属做好儿童防护工作。

本研究发现，新生儿流感嗜血杆菌检出率仅0.24%，检出率低的原因可能是新生儿与外界接触少，大多数新生儿肺炎都是吸入性肺炎，感染多由宫内感染或经产道感染，接触的细菌多为定植菌，与2020年该院统计的数据[4]一致。本研究发现流感嗜血杆菌感染患儿没有男女性别差异，年龄集中在30 d～8岁，并且各年龄段之间存在差异，90%的感染发生在5岁以下儿童。30 d～患儿的病例数和流感嗜血杆菌构成比最高，但是检出率不高，检出率最高的年龄段是4岁～，其次是2岁～，≥6岁病例数明显降低，此现象可能与学龄前儿童免疫系统发育尚未健全，免疫功能低下有关，年龄、性别差异与全国多个地区报道[6-8，11，13]一致。1～5岁儿童流感嗜血杆菌感染率高，估计与此年龄段儿童开始从家庭走进社区，与外界接触增多，感染风险也增加，也间接证明了流感嗜血杆菌克隆在社区传播。

MLST通常被用于细菌的基因分型，判定菌株亲缘关系，了解细菌的群体结构及分子流行病学特点。本研究中，51株流感嗜血杆菌被分为15个ST型，10个克隆群，其中ST107是海口地区春季优势克隆群，其次是ST422、ST103和ST57,另外有5个独立ST型。由此可见，不同个体分离的流感嗜血杆菌ST型具有较大的差异，说明本地区流感嗜血杆菌的流行具有较多的遗传多样性，且具有克隆传播趋势。不足的是，本次用于MSLT的菌株数少，没有覆盖全年各个时间点，无法进行季节性分子流行病学比较。另外，国内尚未见流感嗜血杆菌的分子流行病学的文献，暂时无法进行地域性分子流行病学比较。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。