芸薹子对母鼠及其子鼠生产性能和肠道菌群结构的影响

2022-12-26严念东黄东海樊启文魏金涛

中国饲料 2022年23期

张巍，严念东，黄东海，樊启文，魏金涛*

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治剂创制重点实验室/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064；2.湖北省农业科学院中药材研究所，湖北恩施 445000）

围产期机体因处于高速分解代谢状态，会产生大量自由基，是乳腺炎、子宫炎高发期（殷晓风，2016；林森，2014）。目前围产期炎症治疗方案多使用抗生素，但抗生素一方面会影响畜产品品质，另一方面也会影响幼崽肠道菌群结构从而影响健康，且会产生环境污染、药物残留、细菌耐药性等问题，我国已于2020年7月1日起，饲料企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料，但中草药类除外。我国应用中草药作为饲料添加剂历史悠久，因其具有来源天然、功能多样、安全可靠、经济环保等特点，将取代抗生素占据“无抗”市场。

古籍记载芸薹子为白菜型油菜成熟种子（荆文光，2014），白菜型油菜因抗病力弱、产量低、芥酸含量高，农业种植上已基本淘汰，现种植品种主要为低芥酸、低硫苷的“双低”品种（杜海等，2011）。现代芸薹子除含较低的芥酸和硫苷外，还含有较高的油酸（61%）、亚油酸（21%）、α-亚麻酸（11%）以及植物甾醇和生育酚等成分（Anna Lewinska等，2015），其中n-6多不饱和脂肪酸∶n-3多不饱和脂肪酸的比值为2.84（黄玉华和邓泽元，2007）。研究发现，油酸可有效缓解内质网氧化应激（李萍等，2012）、调节脂类代谢、提高体内抗氧化能力（张佰帅等，2012；李萍等，2011），且可影响脂肪细胞分化过程中脂滴及甘油三酯的形成（金鑫等，2020）。泌乳母猪饲粮中补充一定量富含油酸的橄榄油可显著降低仔猪泌乳期死亡率，提高初乳和常乳乳脂含量，降低乳汁和仔猪血浆中炎症因子浓度（申勇，2015）；补充一定量“双低”熟化油菜籽能显著提高初乳和常乳中固形物和乳脂含量，提高仔猪窝重和平均窝日增重（唐春艳，2015；郭万正等，2014）；而n-3多不饱和脂肪酸不仅可调节母体肠道微生物菌群结构，还可以通过泌乳阶段母体日粮持续调节肠道微生物群来影响后代（Robertson等，2018），不同比例的n-6：n-3能有效调控代谢性内毒素和炎症因子浓度以及机体的免疫性能等，2019；Kanakaraju等，2015；Papadopoulos等，2009）。现代芸薹子对泌乳阶段母体及其子代生长性能以及肠道菌群结构理论上有正向调节作用。为此，本研究采用16S rRNA高通量测序比较分析母鼠泌乳期摄食现代芸薹子后母鼠及其子鼠盲肠微生物菌群结构差异，并通过检测母鼠泌乳性能、母鼠及其子代的免疫性能和抗氧化能力，探讨现代芸薹子的药效机理，为芸薹子在母畜上的正确应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验动物本试验使用动物均为SPF昆明小鼠，由武汉试验动物研究所提供。分别选购6周龄，40只母鼠和10只公鼠，于实验室分开散养1周，待适应后按公母比1：3进行合笼，10 d后取出雄鼠，观察母鼠的怀孕状况，将确认怀孕的母鼠按照每笼1只进行单笼饲养至分娩。选取产仔时间前后相差不超过1 d、体重（55.00±2.00）g的产后母鼠20只，且调整至每只母鼠带仔鼠10只，每窝仔鼠总重差异均不显著。随机分为基础日粮组和试验日粮组，基础日粮由试验动物研究所提供，试验日粮组为在基础饲粮中加入5%的菜籽粉，基础日粮组用同等能量玉米粉代替。饲养至21 d断奶。

1.2 检测指标及方法

1.2.1 母鼠每小时泌乳量测定每天早晨8：00将母鼠取出，用电子天平称量每窝仔鼠的总重，记为m1，此为隔离前的仔鼠窝重。仔鼠用保温箱保温，母鼠正常自由采食和饮水。隔离4 h后，再次称量每窝仔鼠的总重，记为m2，即仔鼠哺乳前窝重。再将每窝仔鼠放回对应母鼠身边进行自由哺乳1 h，然后再次将母鼠和对应仔鼠分开，第三次称量每窝仔鼠的总重，记为m3，即仔鼠哺乳后窝重。再将每窝仔鼠放回对应母鼠身边自由哺乳，当天的泌乳量称量结束。连续称量7 d，每天重复第一天的称量操作过程。

平均日增重=（本周均重-上周均重）/7 d；

母鼠每小时泌乳量=m3-m2+（m1-m2）/4；

式中：m1为隔离前的每窝仔鼠总重，g；m2为仔鼠哺乳前窝重，g，m3为仔鼠哺乳后窝重，g。

1.2.2 体重记录试验子鼠初生窝重、7日龄窝重、14日龄窝重以及21日龄窝重。

1.2.3 血清、组织生理生化指标试验结束后，母鼠、子鼠眼球取血，静置30 min后分离血清于4℃保存，待测；母鼠采血后剥离皮肤，留取第四对乳腺右侧，用生理盐水匀浆于4℃保存，待测。

分别采用Elisa试剂盒法检测催乳素（PRL）和免疫球蛋白（IgG）（试剂盒由泉州睿信生物科技有限公司提供），MDA含量、总蛋白含量、总抗氧化能力、溶菌酶、总氨基酸以及总脂肪含量（试剂盒均有南京建成生物提供）。

1.2.4 肠道微生物留取母鼠、子鼠盲肠内容物，采用16SrRNA对样品V3+V4可变区的PCR产物进行测序，由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 数据处理采用SPSS 18.0进行T检验。试验结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 芸薹子对母鼠泌乳性能的影响由表1可知，母鼠分娩后1～7 d，摄食芸薹子泌母鼠的每天泌乳量均有提高（P＞0.05）；第7天小鼠均重、7天内日均增重均极显著高于对照组（P＜0.01），分别提高了14.84%、23.58%；第14天小鼠均重显著高于对照组（P＜0.05），提高了15.94%；第21天小鼠均重极显著高于对照组（P＜0.01），提高了17.36%。

表1 芸薹子对母鼠泌乳性能的影响g

2.2 芸薹子对母鼠乳腺组织生理生化指标的影响由表2可知，泌乳鼠摄食芸薹子后，与对照组相比，母鼠乳腺免疫球蛋白IgG、总蛋白、总氨基酸含量及乳腺中MDA水平无显著差异（P＞0.05），但有降低乳腺MDA含量的趋势，乳腺溶菌酶含量提高了54.46%（P＜0.05）。

表2 芸薹子对母鼠乳腺生理生化指标的影响

2.3 芸薹子对母鼠及其子鼠血清生理生化指标的影响由表3可知，泌乳鼠摄食芸薹子后，与对照组相比，母鼠及其子鼠血清中免疫球蛋白IgG含量显著下降，分别降低10.86%、12.46%（P＜0.05）。

表3 芸薹子对母鼠及子鼠血清生理生化指标的影响

2.4 芸薹子对肠道菌群结构的影响

2.4.1 测序数据分析经过质控过滤、去除嵌合体，将Effective Tags在97%的相似度水平下进行聚类，6个样品共获得OUTs 3290个。样本稀释曲线，物种累积箱形图曲线位置趋于平缓（图1），表明抽样充分，可以进行数据分析。

图1 样品多样性分析

2.4.2 肠道细菌群落结构组成根据物种注释结果，对四组样品在各分类水平上进行群落结构分析。在门水平，丰度排前10菌群依次为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁门（Firmicutes）、变形门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、某细菌（unidentified_Bacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、螺旋体门（Spirochaetes）、软壁菌门（Tenericutes）、纤维杆菌门（Fibrobacteres）、蓝藻门（Cyanobacteria）（图2A）。在属水平，鉴定出丰度排前10的菌群有拟杆菌属（Bacteroide）、乳杆菌属（Lactobacillus）、瘤胃球菌科某属（unidentified_Ruminococcaceae）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、棒杆菌科某属（unidentified_Corynebacteriaceae）、布劳特氏菌属（Blautia）、罗斯氏菌属（Roseburia）、杜氏杆菌（Dubosiella）、肉杆菌属（Atopostipes）（图2B）。

图2 芸薹子干预后试验母鼠及子鼠肠道菌群丰度变化

2.4.3 肠道细菌群落多样性分析

2.4.3.1 Alpha多样性指数分析 Alpha多样性分析主要关注单样本的多样性，可以反映微生物群落的丰度和多样性，常用的度量指标有Ace、Chao1、Shannon和Simpson、Coverage、PD wholetree。Coverage用于计算测序深度，当Coverage＞99%，说明各样本文库的覆盖率较高，能够代表样本中菌群落的真实信息。Chao1、ACE用于计算菌群丰度，Shannon、Simpson用于计算菌群多样性，PD whole-tree用于计算系统发育多样性。Simpson指数值越大，说明群落多样性越低；其余指数值越大，说明相应的群落丰富度、均匀度和多样性越高。本试验各样品Coverage＞99.9%，能够代表样本中菌群落的真实信息（表4）。

将试验组和对照组的Ace、Chao1、Shannon、Simpson、Coverage、PD whole-tree进行T检验发现，摄食云薹子后，母鼠及其子代肠道菌群丰度和多样性在统计学上没有显著差异（表4）。摄食油菜籽的母鼠肠道共鉴定出1683个OTUs，对照组共有1125个OTUs，其中共同的OUTs有1094个；其子代分别有1142个OUTs、1137个OTUs，其中共同的OUTs有962个（图3）。

表4 芸薹子对母鼠及其子鼠盲肠菌群Alpha多样性的影响

图3 OUT venn图

2.4.3.2 Beta多样性分析摄食云薹子后，与对照组相比，母鼠、子鼠肠道菌群结构均有差异（R=0.7778和R=0.4074），但不显著（P=0.1）（表5）。NMDS分析显示，摄食云薹子后母鼠、子鼠肠道菌群距离均较分散，即不同程度地改变了原有的菌群落结构。GMA聚类分析（binary jaccard算法），母鼠及其子鼠肠道菌群变形门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）丰度明显增加（图4）。

表5 组间群落结构差异显著性检验

图4 芸薹子茶干预后母鼠及子鼠肠道菌群结构分析

分类水平总丰度前10的物种丰度聚类热图显示（图5），母鼠摄食云薹子后，肠道菌群厚壁门（Firmicutes）丰度明显降低，其中杜氏杆菌属（Dubosiella）、乳杆菌属（Lactobacillus）显著降低，而苏黎世杆菌属（Turicibacter）、肉杆菌属（Atopostipes）、布劳特氏菌属（Blautia）丰度显著增加。变形门（Proteobacteria）嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、放线菌门（Actinobacteria）棒杆菌科某属（unidentified_Corynebacteriaceae）丰度显著增加，拟杆菌门（Bacteroidetes）拟杆菌属（Bacteroide）明显增加。T检验分析，摄食云薹子母鼠肠拟杆菌门（Bacteroidetes）拟杆菌属（Bacteroide）、帕拉普氏菌属（Paraprevotella）显著增加（P=0.029，P=0.048），Odoribacter菌显著减少（P=0.018）（图6）。LEfSe分析，摄食云薹子母鼠Biomarker菌群为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门假单胞菌目（Pseudomonadaies）、莫拉菌科（Moraxellaceae）、拟杆菌门拟杆菌科（Bacteroidaceae）拟杆菌属（Bacteroides）和厚壁门苏黎世杆菌属（Turicibacter）。进化分支图显示，放线菌门、拟杆菌门拟杆菌科、变形菌门假单胞菌目莫拉菌科菌群发挥主要作用（图7）。

图6 T-test母鼠组间属水平上差异统计

图7 母鼠LDA值分布柱状图和进化分支图

综合以上分析，泌乳鼠摄食芸薹子后，母鼠盲肠放线菌门棒杆菌科某属（unidentified_Corynebacteriaceae）、拟杆菌门拟杆菌科拟杆菌属和帕拉普氏菌属以及变形菌门假单胞菌目莫拉菌科嗜冷杆菌属变化明显。而对照组母鼠优势菌群为厚壁门梭状芽孢杆菌纲梭菌目菌群。

母鼠摄食云薹子后，其子代肠道菌群中拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度显著降低，但拟杆菌属（Bacteroides）丰度却显著增加（图5）；未鉴定细菌（Unidentified-bacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、螺旋体门（Spirochaetes）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、纤维杆菌门（Fibrobacteres）、厚壁门（Firmicutes）丰度明显增加。厚壁门（Firmicutes）乳杆菌属（Lactobacillus）明显降低，苏黎世杆菌属（Turicibacter）、罗斯氏菌属（Roseburia）、瘤胃球菌科某属（Unidentified-Ruminococcaceae）、布劳特氏菌属（Blautia）增加（图5）。LEfSe分析，子鼠肠道Biomarker菌群为拟杆菌属酸化菌类（Bacteroidesacidifaciens）和Alistlpes-indistinctus；而对照组子鼠优势菌群为芽孢杆菌纲（bacilli）乳杆菌目lactobacillales乳杆菌科lactobacillaceae和Muribacillaceae乳杆菌属Lactobacillus（图8）。

图5 芸薹子干预后小鼠肠道菌群在门水平和属水平上相对丰度热图分析

图8 LDA值分布柱状图和进化分支图

综合以上分析，泌乳鼠摄食芸薹子后，子鼠盲肠厚壁菌门丰度增加，但乳杆菌属下降；拟杆菌门丰度下降，但拟杆菌属丰度增加。

对每组属水平丰度前10的菌落进行功能预测，摄食云薹子后，母鼠肠道菌群结构更倾向于尿素分解代谢、硝酸盐的代谢以及木聚糖的分解等，即母鼠蛋白质代谢和碳水化合物代谢加强，而子鼠更倾向于化学异位作用和发酵作用（图9）。

图9 功能预测

3 讨论

3.1 芸薹子对母鼠泌乳性能的影响为提高母猪的繁殖性能，在母猪妊娠后期及泌乳期往往补充代谢利用效率高的油脂来减少母猪因生产和泌乳导致的体损失。母猪妊娠后期添加脂肪能提高初乳产量、增加初乳中总脂质、乳糖量和IGF-1浓度，从而增加新生仔猪的存活率以及泌乳期仔猪的增重（Laws等，2018；Jin等，2017；Krogh，等2012）。本研究结果显示，芸薹子对母鼠分娩后一周内的泌乳量没有显著影响，但显著提高了小鼠7、14、21日龄均重，极显著提高了分娩1周内小鼠的日均增重。因本试验条件下无法采集乳样品，虽然试验组泌乳量无差异，但可能改变了乳成分。

3.2 芸薹子对母鼠及其子鼠免疫性能、抗氧化性能的影响乳腺组织由一系列防御机制保护，分为先天性免疫和特异性免疫，在乳汁及乳腺组织中存在有许多可溶性因子如特异性免疫球蛋白、非特异性溶菌酶等杀菌成分发挥防御作用。本试验中，泌乳鼠摄食芸薹子后，母鼠乳腺免疫球蛋白IgG、总蛋白、总氨基酸含量及MDA水平无显著差异，但却显著提高了乳腺溶菌酶含量。

免疫球蛋白IgG是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白，也是主动免疫后机体产生的主要抗体，因此血清中免疫球蛋白IgG含量可以反映机体体液免疫状况。妊娠期补充膳食脂肪能改善产奶当天初乳质量和催乳素浓度，从而影响母猪肠道形态和先天免疫功能（Xeng等，2019）；从妊娠后期至断奶补充鱼油或者亚麻籽粉均能增加母猪初乳以及泌乳期仔猪血清免疫球蛋白IgG浓度（田美丽等，2016；Wu等，2015；罗杰，2009），但鱼油提高了母猪初乳及常乳中炎症因子浓度和MDA含量，以及母猪、仔猪血浆中MDA含量（申勇，2015），后代易发生肠道病变并改变免疫细胞稳态（Gibson等，2015）；泌乳母猪日粮中n-6：n-3多不饱和脂肪酸的比例会影响免疫球蛋白和免疫细胞因子的分泌（Yao等，2012），低n-6：n-3比率可改善母猪围产期代谢变化和炎症状况（Papadopoulos等，2009）；但也有研究认为，母猪日粮n-3PUFA对断奶仔猪的适应性免疫和先天性免疫无明显影响（Tanghe等，2014）。目前研究均证明，富含油酸的橄榄油、菜籽油或油菜籽、油茶籽均能增强体内抗氧化能力和自由基清除酶的活性，降低脂质过氧化物含量（申勇，2015；吴琪和杨洁，2011），一定剂量植物油能显著提高肠道功能酶活性从而促进消化（杨晓燕等，2020），也有油茶籽增强小鼠体液免疫的报道（张东生等，2013），但鲜见有菜籽油或油菜籽增加机体免疫力的相关报道。本试验中，泌乳鼠摄食含有芸薹子的饲粮后，母鼠及子鼠血清中IgG含量显著降低，即对母鼠和子鼠的体液免疫有抑制作用，这可能由于加入芸薹子后改变了试验组饲粮脂肪酸组成导致，需要进一步研究证明。

3.3 芸薹子对肠道菌群结构的影响动物肠道存在着庞大的微生物群落，由于解剖结构和生理特性的差异，胃肠道各部位菌群在种类、丰度上也明显不同。盲肠的结构有利于食糜停留，结肠中食糜的流通速度缓慢，发酵物质多，所以结肠、盲肠中微生物在数量和多样性上都是肠道中最为丰富的。盲肠和结肠在门水平菌群结构非常相似，有超过90%的细菌归属于厚壁菌门和拟杆菌门。肠道微生物不仅影响着食物的消化与吸收，饮食结构也影响肠道微生物结构（谭振，2018）。

小鼠盲肠的优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）。本研究结果显示，在门水平泌乳母鼠及子鼠肠道优势菌群依次为拟杆菌门、厚壁菌门、变形门、放线菌门。摄食云薹子后，母鼠厚壁菌门（Firmicutes）丰度下降，拟杆菌门、变形门、放线菌门丰度增加；在属水平，厚壁菌门杜氏杆菌属、乳杆菌属丰度下降，拟杆菌门拟杆菌属、帕拉普氏菌属（Paraprevotella）丰度增加。此外，放线菌门棒杆菌科某属、变形菌门假单胞菌目莫拉菌科嗜冷杆菌属丰度增加，而对照组母鼠优势菌群为厚壁门梭状芽孢杆菌纲梭菌目菌群。而与对照组相比，摄食云薹子试验组子代盲肠菌群中拟杆菌门丰度降低，厚壁菌门丰度增加；属水平拟杆菌属丰度增加，乳杆菌属丰度降低，拟杆菌属酸化菌类（Bacteroides-acidifaciens）和Alistlpes-indistinctus为肠道菌群的Biomarker。即摄食芸薹子后，母鼠及其子鼠增强机体免疫力的乳杆菌属下降，促炎症类相关的普氏菌属、拟杆菌属丰度增加，而这种菌群变化是否导致机体免疫球蛋白IgG含量下降、溶菌酶增加需要进一步研究证明。