呼吸道病原体检测平台应用进展*

周承勃森，贾 红 综述，鞠长燕 审校

1.西南医科大学公共卫生学院，四川泸州 646000；2.广东省深圳市南山区疾病预防控制中心，广东深圳 518000

呼吸道感染(RTIs)是临床感染性疾病的主要死因[1-2]。呼吸道感染在2019年世界常见死亡原因中排名第四，造成了全球超过290万人的死亡[3-4]。近年来，呼吸道感染新发病原体不断出现，从严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、甲型流感病毒 H7N9 亚型，到严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，新型呼吸道感染病原体给公共卫生防控带来严峻挑战的同时，也给社会造成了巨大的经济损失[5-7]。

了解呼吸道感染的病原学，并对病原体进行早期、快速、准确的筛查对呼吸道感染性疾病的控制至关重要[8]。由于传统的检验方法在进行呼吸道病原体检测时检测速度慢(2～5 d)、通量低，以及在面对呼吸道未知微生物时存在局限性，高通量的检验方法得以发展[9-10]。有研究表明，呼吸道感染高通量检测技术不仅能实现快速检测，还可以显著减少抗菌药物的使用，具有很高的社会效益和经济效益[10-11]。近年来，呼吸道病原体检测技术不断创新，新的呼吸道病原体检验平台不断推出[12-13]。如何选用呼吸道病原体检测平台以实现成本-效益的最大化，成为专业人员关注的问题。本文对目前常见呼吸道病原体检测的商品化平台进行综述，意在了解目前高通量呼吸道病原体检测平台的性能，以期为呼吸道病原体检测平台的临床实践提供参考。

1 基于传统呼吸道病原体检测技术的检测平台

1.1基于免疫法的检测平台 免疫化学检测法是利用免疫学抗原抗体反应，以荧光素、酶、放射性核素或电子致密物质等对抗原或抗体加以标记，对某些蛋白质(抗原或抗体)进行检测的技术[14]。ArcDia公司的mariPOC是一种基于免疫化学检测法的双光子荧光激发检测系统，其原理是待检抗原先被特异性抗体捕获，带有荧光标记的抗体再与其结合，进而实现病原体检测[15]。mariPOC具有完全自动、可现场使用、约20 min自动报告的特点[15]。其呼吸道面板(respi)可检测来自上、下呼吸道的9种临床相关病原体[15]。GUNELL等[16]联合芬兰14个实验室共进行了22 485次检测，证明了mariPOC®respi在日常监测中的有效性。

1.2基于多重PCR技术的检测平台 多重PCR技术可以同时检测同一标本中的呼吸道临床常见病原体。其工作原理主要是应用多重引物，先针对不同的病原体核酸进行特异性扩增，再根据不同病原体的扩增产物判断感染何种病原体[17]。市场上有多种基于多重PCR的呼吸道病原体检测试剂，可同时检测数种呼吸道病原体，适用于绝大多数型号的PCR仪，但其检测通量不高。以下是两种试剂与仪器配套的一体化PCR检测平台，其检测通量较高，可同时检测十几种呼吸道病原体。

1.2.1多重荧光PCR平台 多重荧光PCR技术是在多重PCR 技术的基础上，加入了几种不同荧光基团，通过检测不同通道的荧光，实现对多个靶标的实时检测[17]。Unyvero是由Curetis 公司开发的一种基于多重荧光PCR的检测系统，可对下呼吸道多重病原体与耐药基因进行检测和鉴定[18]，该系统使用单个检测阵列在多孔阵列膜上杂交实现定性扩增检测[19]。其配套面板包括Unyvero P50/P55。Unyvero P50可检测17种肺炎病原体及耐药基因[20]。Unyvero P55肺炎面板可检测21种呼吸道病原体以及17种耐药基因[21]。该系统自动化，检测全程大约需要5 h[20-21]。PAPAN等[20]报道，与培养相比，Unyvero P50的总体特异性较高，对于耐药基因的检测，75%与抗生素图谱一致。

1.2.2多重反转录聚合酶链反应(多重RT-PCR)结合毛细管电泳平台 多重RT-PCR结合毛细管电泳，即在多重RT-PCR的产物分析过程中，以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间分配行为差异实现分离的分析方法[22]。Beckman Coulter公司开发的GeXP是一种多重RT-PCR结合自动毛细管电泳的商品化系统。使用GeXP，能够在一根试管中对最多达30个基因的表达谱进行差异评估，其周转时间低于5 h[23]，GeXP检测成本较低，每次综合检测的成本约为8美元[24]。LUO等[25]的研究表明GeXP检测中各病毒检测的灵敏度与近年来报道的实时PCR方法相似。

1.3基于多重连接探针扩增(MLPA)技术的检测平台 MLPA是一种可以同时定量检测多个靶基因的方法。MLPA 技术的基本原理是通过合理设计针对靶序列片段的2个特异探针，结合高度特异的杂交反应，并对杂交后的连接产物进行 PCR 扩增和毛细管电泳，最后比较扩增片段长度或判定扩增片段的有无，实现对未知靶序列的鉴定[26]。QIAGEN公司的RespiFinder 是一种基于MLPA技术的多参数测试面板，它通过多重连接探针扩增和电泳分析，通过对每个探针根据其特定长度进行识别，完成病原体检测[27]。RespiFinder Smart 面板可以同时分析15例患者标本，区分22种病原体，其运行时间低于6 h[28]。REIJAN等[27]的研究表明与细胞培养结果相比，RespiFinder检测的特异度和灵敏度均高于92%。多项研究结果表明，该方法的灵敏度与单倍实时RT-PCR相当，人工操作时间比RT-PCR减少了一半以上[27-29]。

1.4基于传统检测技术的呼吸道病原体检测平台性能对比 基于传统呼吸道病原体检测技术的商品化平台大大扩展了检测的通量，并缩短了检测的时间，详见表1。在基于传统呼吸道检测技术的检测平台中，免疫法的mariPOC检测时间最短，主要用于呼吸道常见病原体的现场检测。基于多重PCR技术的Unyvero，可实现对下呼吸道病原体的检测，特别的是，它还可用于下呼吸道病原体耐药基因的检测。

表1 基于传统呼吸道病原体检测技术的检测平台的特性

2 基于生物芯片技术的检测平台

2.1液相悬浮芯片技术的检测平台 液相悬浮芯片技术也称微球体悬浮芯片技术(SAT)，即通过在不同编码的微球上进行抗原抗体、酶底物、配体受体的结合反应及核酸杂交反应，再通过不同的激光分别对微球编码和报告荧光进行定性和定量检测，从而实现蛋白质、核酸等多种生物大分子的多重检测，通过微球的分类标记，可实现一次对标本中多达100个不同的目标进行检测[30-31]。Thermo Fisher公司的Luminex系统采用SAT技术。其配套检测试剂盒包括xTAG RVP、NxTAG RPP。xTAG RVP适用于48个样品，可同时检测18种常见呼吸道病毒，检测周期为5 h；NxTAG RPP适用于96个样品，可同时检测21种呼吸道病原体，检测周期小于4 h[32]。目前，市售的悬浮阵列试剂盒成本较低[33]。HANSON等[34]的研究表明Luminex系统灵敏度高，是ELISA灵敏度的10～100倍，重复性好，可达90%以上。

2.2微流控基因芯片技术的检测平台 微流控基因芯片技术是微流控系统将不同实验室系统微缩在玻璃或者塑料机上，在微米级的尺度上构建液流通道、核酸提取池、反转录和PCR扩增池、杂交池等部件，整合了标本处理、反应、检测的全部流程，从而实现高通量检测[35]。微流控基因芯片技术的微型化、高灵敏度、高通量以及低检测时间等技术优势，使其在生物医学研究中应用广泛[35]。

2.2.1FilmArray Bio Fire公司的FilmArray是一套基于微流控技术的商品化系统。FilmArray拥有的呼吸道检测面板包括BioFire®RP、BioFire®RP2、BioFire®Pneumonia面板[36]。其中，RP面板可靶向19种病原体；RP2面板可靶向21种病原体；Pneumonia 面板可靶向32种病原体[36]。手工操作只需2 min，大约1 h即可获得结果[36]。FilmArray单次检测价格约为200美元，FilmArray经过FDA认证，大量研究表明其对多数病原体的灵敏度和特异度高达95%以上[37-38]。

2.2.2GenMark GNMK公司的GenMark 同样是基于微流控的商品化系统，目前已被Roche公司收购。与传统微流控设备不同的是，其病原体检测采用二茂铁标记的寡核苷酸探针，它通过介质上电润湿的方式改变阻抗，从而对病原体进行检测[39]。GenMark系统单次最多检测26个标本[40-41]。其ePlex RP面板可检测17种呼吸道病原体，每次分析的分析时间小于2 h，单次检测成本约90美元[39]。一项多中心临床试验，使用BioFire RP面板作为比较方法，评估ePlex RP Panel检测性能，ePlex RP和BioFire RP面板对所有目标的总体一致性超过95%[42]。

2.2.3QuantStudioTM7 Flex Thermo Fisher公司的QuantStudioTM7 Flex系统采用集成的Taqman@(TAC)低密度微流控卡作为面板，最多可同时进行384个个体的实时PCR反应，每个微流控卡最多可检测8个标本，每个标本最多可同时进行42种病原体的检测[43]。在面板更新的情况下，TAC可根据研究目的修改引物/探针组，且不需要重新验证整个面板[43]。LIU等[44]的研究中表明，TAC的灵敏度和特异度均较高。

2.3基于生物芯片技术的检测平台性能对比 基于生物芯片技术的呼吸道检测平台相较于基于传统呼吸道病原体检测技术的平台具有更高的准确性和更快的检测时间，详见表2。其中，值得一提的是基于微流控基因芯片的QuantStudioTM7 Flex，其Taqman®(TAC)呼吸道病原体检测面板可在无需验证面板的情况下，根据研究目的修改探针组，最多可实现42种病原体的检测。

表2 基于生物芯片的呼吸道检测平台的特性

3 二代测序技术平台

二代测序技术是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术，二代测序通过在DNA复制过程中(RNA需反转录为cDNA)，捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记来确定目标序列[45]。由于在二代测序中，随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，测序质量下降，因此，二代测序具有通量高但读长短的特点[46]。

3.1二代测序平台分类

3.1.1焦磷酸测序平台 焦磷酸测序，即在DNA聚合反应中释放焦磷酸(PPi)，并将焦磷酸用作特定碱基掺入的指示物，依次添加和去除4个碱基，通过检测由发光的酶级联释放的焦磷酸盐完成测序[47]。QIAGEN公司的 PyroMark采用焦磷酸测序法，Roche公司的Roche 454 在此基础上采用了一种“水包油”的扩增方法，即在扩增时使用了包含160多万个光纤孔的平板，其中，每个孔是一个独立的PCR体系，所有的DNA模板都被链接在孔中水油包被的一个磁珠上[48]。焦磷酸测序开拓了二代测序，但有其局限性：均聚物测序不准确，添加超过5个相同的核苷酸不能有效检测，其成本也相对较高[48]。目前，焦磷酸测序已经被淘汰[48]。

3.1.2氢离子测序平台 氢离子测序即克隆乳液中单个核糖核酸，然后将其放置在一个包含单个pH传感器矩阵的半导体芯片上，当DNA克隆通过合成进行测序时，局部pH值的变化可确定测序的核苷酸[48]。Thermo Fisher 公司的Ion Torrent平台，采用氢离子测序。在应用中，这项技术检测速度快，可以实时测序，而且成本低[49-50]。然而，有研究表明，该技术均聚物测序容易出错，因为在一个循环中重复使相应数量的氢离子释放，导致出现更高比例的电子信号[49-50]。

3.1.3边合成边测序平台 边合成边测序采用桥式扩增策略，即通过将单个DNA分子附着在流动细胞上，然后将其局部扩增成克隆簇；在接下来的测序和合成过程中，它构建互补DNA，采用荧光标记核苷酸的光学读出，然后确定其碱基身份(A，T，C，G)[51]。在每个测序周期中，4种核苷酸之间的自然竞争减少了与焦磷酸测序相比的固有偏差。因此，均聚物的测序错误被这种技术克服[52-53]。Illumina公司开发了这种方法，约63%的测序工作是在该测序平台上进行的，此外，Illumina在所有测序仪中拥有最高的通量[54]。

3.1.4杂交与连接测序平台 杂交与连接测序法利用DNA连接酶来连接DNA序列中给定位置的核苷酸，通过已知序列对未知的目标DNA序列进行碱基配对和进行测序[55]。阅读长度是该方法的一个主要限制[56]。CG公司的Complete Genomics采用连接法测序，后期被华大基因收购。特别的是，Complete Genomics在构建测序文库时基因片段的两端加了接头，形成环状DNA 模板。其拷贝序列采用类似滚环的扩增方式，其单克隆球状体也被称为DNA 纳米球，利用锚定序列与碱基单链荧光探针混合物在连接酶作用下连接获得DNA 序列信息。该方法是分段进行的，拥有较高的容错能力，后期的拼接也较容易[56]。

3.2基于二代测序技术的呼吸道检测平台性能对比 二代测序技术自焦磷酸测序以来不断发展，目前已成为临床常规病原学检测技术的重要辅助手段，其检测平台特性详见表3。其中，采用边合成边测序技术的Illumina平台占据了大量市场[54]。我国的华大基因在收购杂交与连接测序平台Complete Genomics后，也推出了国产的二代测序仪。

表3 基于二代测序技术的呼吸道检测平台的特性

3.3二代测序技术在呼吸道病原体检测中的应用 (1)病原体检测。MIAO等[57]在比较二代测序技术与培养对病原菌诊断效果的同时，评估抗生素暴露对检出率的影响，结果表明，二代测序技术的灵敏性优于培养，二代测序技术具有较高的病原菌识别灵敏性，且不受先前接触抗生素的影响，因此成为一种有前景的传染病检测技术。LI等[58]的研究表明，二代测序技术可提供全基因组序列，帮助确定病毒亚型和血清型。(2)多重耐药基因检测。QUAN等[59]利用二代测序技术开发了一种靶向测序方法，这种方法快速、廉价、多路复用能力强，而且足够灵活，可以靶向任何感兴趣的序列，并且可检测患者标本中抗菌药物的多重耐药基因。SAHOO等[60]开发了一种基于扩增子的高通量测序策略，与现有的耐药突变基因型检测方法相比，该方法对微小变异体的检测更加灵敏，具有更高的多路复用能力。(3)传染病防治。德国一名患者出现急性呼吸窘迫综合征症状，使用PCR和分离培养方法检测多种病原体均为阴性，FISCHER等[61]通过二代测序技术在 50 h 内快速确定了致病病原体是鹦鹉热衣原体，随后根据基因序列设计引物，并使用 PCR 验证了检测结果。在2019年末武汉SARS-CoV-2疫情中，研究者们通过二代测序技术实现了对病原体的快速鉴定及病毒全基因组序列的获取，并通过此病毒的特有基因序列，设计RT-PCR引物，生产了用于感染者病原学诊断的试剂盒[62]。

二代测序技术的缺陷在于：(1)实验结果难以解释检出的病原体为背景微生物还是病原微生物[63]。(2)目前进行二代测序技术检测的工作流程高度个体化，不同的操作流程仅适用于特定的感染类型或标本类型；由于工作流程缺乏方法标准化和验证，容易造成人为污染，最终导致结果的不确定[64]。(3)中国单次标本的成本是3 000元人民币(约合400美元)，高于任何单一的通用方法[57]。

4 结 语

目前，对于医疗机构，特别是基层医疗机构而言，因资金不足、样本量太大不能进行检测，或因检测时间、检测结果不能满足临床需求的现象仍普遍存在[65]。未来，随着分子诊断技术的不断发展，呼吸道疾病病原体核酸检测技术将朝着高通量、快速、自动化、低成本的方向发展。本文对常见的呼吸道病原体检测平台进行综述，将有助于临床医师以及研究人员结合专业知识，合理选用呼吸道病原体的诊断方法，以实现成本-效益的最大化。