FJX1基因在结肠癌中的临床意义

薛 丽，黄 奔

南京医科大学第一附属医院检验学部，江苏南京 210009

人类四连接同源 (FJX1) 基因与果蝇高尔基体固有跨膜激酶(Fj) 基因高度同源，位于11号染色体(11p13)，可以编码含有437个氨基酸的表面分泌蛋白[1]。FJX1基因可以在神经系统、多个器官的上皮细胞和肢体发育过程中表达，对生物体的发育起着重要的作用[2-3]。有研究指出，FJX1 基因可以作为致癌基因，通过多种信号途径影响肿瘤的发生、发展。FJX1 基因被报道在鼻咽癌[3]、黑色素瘤[4]、头颈癌[5]等多种肿瘤中发挥了重要的作用。虽然有研究指出，FJX1 mRNA和蛋白在晚期结直肠癌上皮细胞中表达上调[6]，但研究者并未探讨FJX1基因表达与结肠癌患者临床病理参数、预后的关系。因此，本研究通过数据挖掘癌症基因组图谱(TCGA)数据库，利用生物信息学的方法，综合多种数据库加以验证，探讨FJX1 基因在结肠癌中的临床意义、预后价值以及FJX1 基因在结肠癌中的分子作用机制，旨在为结肠癌的诊治提供新型分子标志物。

1 材料与方法

1.1数据下载与处理 登陆TCGA官方数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)，下载结肠癌转录组测序数据(level 3,HTSeq-FPKM) 和患者的临床资料。患者的临床数据包括年龄、性别、肿瘤TNM分期、生存状态以及随访时间。共下载结肠癌组织标本473例、正常组织标本41例。在后续分析中，删除临床数据不完整或者缺失的标本86例，纳入387例结肠癌组织标本，其中男性患者203例，女性患者184例；年龄>65岁患者235例，≤65岁患者 152例；Stage分期Ⅰ～Ⅱ期患者224例，Ⅲ～Ⅳ期患者163例；存活患者291例，死亡患者96例；最长随访时间为4 502 d。使用R 4.1.2软件提取基因表达数据并进行归一化处理。在后续分析中，根据FJX1基因在结肠癌患者中表达水平的中位值，将患者分为高表达(>中位值)、低表达(≤中位值)。

1.2FJX1基因在结肠癌中的表达以及与临床特征关系的分析 根据TCGA结肠癌数据集的临床资料，分析FJX1基因在结肠癌组织中的表达情况，探讨FJX1基因表达与结肠癌患者临床特征(年龄、性别、肿瘤分期)的关系。同时，使用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html) 验证分析FJX1基因在结肠癌组织中的表达情况。在UALCAN数据库中，共下载结肠癌组织标本286例、正常组织标本41例。在分析TP53基因突变的时候，删除4例信息缺失的标本。在后续分析中，删除临床数据不完整或者缺失的标本7例，纳入279例结肠癌组织标本，其中男性患者156例，女性患者123例；年龄>65岁患者177例，≤65岁患者102例；Stage分期Ⅰ～Ⅱ期患者155例，Ⅲ～Ⅳ期患者124例；存活患者183例，死亡患者96例；最长随访时间为4 000 d。

1.3FJX1基因表达与结肠癌患者预后关系的分析 根据结肠癌患者的生存资料，结合FJX1基因的表达情况，分析高、低表达患者总体生存率的差异。在本研究中，利用UALCAN数据库、GEPIA2数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/)和OncoLnc在线数据库(http://www.oncolnc.org) 验证分析FJX1基因表达与患者总体生存率的关系。其中，在GEPIA2数据库中，共下载结肠癌组织标本275例、正常组织标本41例。275例结肠癌组织标本中男性患者192例，女性患者83例；年龄>65岁患者165例，≤65岁患者110例；Stage分期Ⅰ～Ⅱ期患者149例，Ⅲ～Ⅳ期患者126例；存活患者165例，死亡患者110例；最长随访时间为5 400 d。在OncoLnc数据库中，共下载结肠癌组织标本440例，正常组织标本41例。440例结肠癌组织标本中男性患者239例，女性患者201例；年龄>65岁患者215例，≤65岁患者225例；Stage分期Ⅰ～Ⅱ期患者239例，Ⅲ～Ⅳ期患者201例；存活患者342例，死亡患者98例；最长随访时间为4 502 d。

1.4基因富集分析 使用R4.2.2软件对FJX1基因进行功能富集分析，探讨FJX1基因在结肠癌中的分子作用机制。采用加权富集法分析，分析的通路来自Molecular Signature Database (Msig-DB)数据库中的 c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 数据集。参数设置随机组合次数1 000次。错误发现率(FDR)小于0.05和P<0.05的基因集作为显著富集的基因集。此外，为了充分研究FJX1基因的生物学功能，使用STRING数据库 (https://cn.string-db.org/) 探索与FJX1基因相互作用的基因网络，对网络中的基因进行基因本体 (GO)富集分析，探讨其参与的生物学过程 (BP)、细胞学组分(CC)和分子功能(MF)。

1.5统计学处理 使用SPSS Statistics 25.0统计学软件及R 4.2.2软件进行统计学分析。采用Mann-WhitneyU检验比较FJX1基因在癌组织和正常组织中的表达差异，采用χ2检验分析在患者不同临床病理参数下FJX1基因的表达差异，采用Kaplan-Meier法和Cox回归分析探讨FJX1基因表达对预后的判断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1FJX1基因在结肠癌组织中的表达 在TCGA结肠癌数据集中，相比于正常组织(FJX1基因表达水平中位值为0.261)，FJX1基因在结肠癌组织中的表达(中位值为1.761)显著升高，差异有统计学意义(P<0.001),见图1A。与相应的癌旁组织(中位值为0.261)相比，癌组织中的FJX1基因表达水平(中位值为1.960)显著升高，差异有统计学意义(P<0.001),见图1B。此外，在UALCAN数据库中，结果也显示FJX1基因在结肠癌组织表达(中位值为2.150)显著高于正常组织(中位值为0.350)，差异有统计学意义(P<0.001),见图1C；与未发生TP53基因突变的组织标本(中位值为1.939)相比，发生TP53基因突变的组织标本FJX1基因表达水平(中位值为2.255)显著升高，差异具有统计学意义(P=0.031)，见图1D。

注：A为在TCGA结肠癌数据集中FJX1基因表达情况；B为在TCGA结肠癌数据集中癌组织和相应癌旁组织中FJX1基因表达情况;C为在UALCAN数据库中FJX1基因表达情况；D为在TCGA结肠癌数据集中具有TP53基因突变标本与TP53基因未突变标本之间FJX1基因表达情况。

2.2FJX1基因表达与结肠癌患者临床特征的关系 根据FJX1基因表达水平中位值1.761，将结肠癌患者分为高、低表达。结果显示，FJX1基因表达水平在患者不同Stage分期、M分期中比较，差异均有统计学意义(均P=0.038)，见表1。

表1 FJX1基因表达与结肠癌患者临床特征的关系

在TCGA结肠癌数据集中，FJX1基因在不同分期的患者中表达情况如图2所示。其中，Stage分期Ⅳ期患者FJX1基因的表达量显著高于Stage分期Ⅰ期的患者，差异具有统计学意义(P=0.023)；M1期患者的FJX1基因的表达量显著高于M0期的患者，差异具有统计学意义 (P= 0.044)。

注：A表示FJX1基因在患者不同Stage分期中的表达情况；B表示FJX1基因在T分期中的表达情况；C表示FJX1基因在M分期中的表达情况;D表示FJX1基因在N分期中的表达情况。

2.3FJX1基因表达与结肠癌患者预后的关系 Kaplan-Meier生存分析结果显示，高表达FJX1基因组的患者总体生存率显著低于低表达的患者(P=0.007)，见图3A。此外，在UALCAN数据库、GEPIA2数据库和OncoLnc数据库中，均显示了高表达FJX1基因组的患者预后不良 (P<0.05)，见图3B～D。

注：A为在TCGA结肠癌数据集中FJX1基因表达与结肠癌患者总体生存率的关系；B为UALCAN数据库中FJX1基因表达与结肠癌患者总体生存率的关系；C为GEPIA2数据库中FJX1基因表达与结肠癌患者总体生存率的关系；D为在OncoLnc数据库中FJX1基因表达与结肠癌患者总体生存率的关系。

2.4Cox回归分析 单因素Cox回归分析结果显示，年龄、TNM分期和FJX1基因表达均在结肠癌不同预后患者中差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。而多因素Cox回归分析结果显示，年龄(HR=1.043,95%CI:1.022～1.065,P<0.001)、T分期(HR=1.981,95%CI:1.177～3.336,P=0.010)、FJX1基因表达(HR=1.133,95%CI:1.025～1.253,P=0.015)可以作为患者预后的独立影响因素。

表2 Cox回归分析

2.5基因富集分析 基因富集分析结果显示，FJX1基因主要参与了致癌相关信号途径、细胞黏附分子、趋化因子信号通路、补体和凝血级联、细胞因子受体相互作用、细胞外基质(ECM)受体相互作用、Hedgehog(Hh)信号通路等分子作用通路。使用STRING数据库探索与FJX1基因相互作用的基因网络，结果显示，共有10个基因与FJX1基因互相作用 (图4A)。GO富集分析结果显示，这些基因与FJX1基因共同参与了细胞黏附、细胞因子受体作用、癌症信号途径等生物学过程；参与了细胞顶端、细胞连接、细胞外泌体等细胞学组分；参与了钙离子、蛋白激酶激活、受体配体作用等分子功能 (图4B)。因此，FJX1基因可以通过细胞黏附、细胞因子受体作用、ECM受体作用以及癌症相关信号途径发挥其生物学功能。

注：A图为STRING数据库中与FJX1基因相互作用的基因网络图；FAT1～4即脂肪非典型钙黏蛋白1～4;DCHS1～2即钙依赖性细胞黏附蛋白;COMMD9即铜代谢结构域蛋白-9;SYNGR3即神经细胞囊泡循环蛋白3;TRIM44即含三联基元蛋白44;FAM20A即序列相似家族20成员A;B图为GO富集分析结果图。

3 讨 论

人类 FJX1基因与在果蝇和小鼠中的直系同源物具有 29% 和 88% 的同源性[6]。在果蝇体内，Fj是生长发育和平面细胞极性调节所必需的[7]，而在小鼠体内，FJX1基因存在于发育中的大脑中，纯合型FJX1基因小鼠在大脑海马中会表现出异常形态的树突结构，在体外培养时，这些小鼠的海马神经元会表现出更高水平的树突延伸和分支[8]。因此，这些研究强调了FJX1基因在不同生物体发育中的重要性。尽管FJX1基因在人类中的确切生物学功能尚不完全清楚，但来自发育研究的数据表明，FJX1基因参与调节细胞的生长和分化，在多种人类疾病中发挥了重要的作用[9]，FJX1基因在癌症发展中的作用可能与其在促进生长和细胞运动中的作用有关[3]。目前许多研究已经证实FJX1基因在人类癌症中过表达，如乳腺癌[10]、肺癌[11]等，这表明了FJX1基因可能是癌症的分子驱动因素。

在鼻咽癌组织中，FJX1基因和蛋白水平均表达上调，促进了癌细胞增殖和侵袭[3]。与正常卵巢内皮细胞相比，FJX1 mRNA在卵巢肿瘤内皮细胞中表达上调[12-13]。CHANG等[14]的研究发现，与无子宫内膜异位症的女性相比，FJX1基因表达水平在异位子宫内膜分泌期显著升高。在结直肠癌中，CUI等[15]研究者构建了miRNA-mRNA调节网络以揭示结直肠癌的发病机制，并指出了FJX1等基因可以作为结直肠癌的关键基因。然而，关于FJX1基因在结肠癌中的临床意义和预后作用，目前鲜有研究报道。

本研究通过数据分析发现，FJX1基因在结肠癌组织中表达上调，并且与患者的Stage分期和远处转移相关，这表明FJX1基因表达参与了结肠癌患者的恶性进展。高表达FJX1基因患者总体生存率较低，这表明FJX1基因影响患者的生存，可以作为结肠癌潜在的预后分子标志物。有研究指出，在结直肠癌组织中，FJX1基因的表达与血管生成基因如低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子受体、血管内皮生长因子C的变化显著相关，FJX1基因可以通过HIF-1α依赖性方式促进内皮细胞毛细管的形成[6]。因此，研究者认为FJX1基因是一种新型的肿瘤进展调节因子，FJX1基因增强血管生成的能力可能解释了FJX1基因高表达的患者总体生存率较低。

基因富集分析结果显示，FJX1基因表达参与了多种信号途径，如调控细胞分化与增殖、ECM受体途径[16]，与肿瘤转移和恶性进展相关的通路[17]，与肿瘤发生、侵袭和转移相关的细胞因子途径[18-19]等。分子机制研究指出，FJX1基因的过表达可以通过上述多种途径参与肿瘤的发生与发展。Hippo通路在调节细胞增殖和凋亡方面发挥着关键作用，FJX1基因是该通路中YAP和TAZ癌基因的直接靶标[20]，FJX1蛋白过表达还可以进一步反馈调节YAP的激活，参与癌细胞的增殖途径[21]。FJX1基因过表达后细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和E1(cyclin E1)的表达水平也相应增加，这表明FJX1基因可以协同调节细胞周期的关键蛋白来增强癌细胞增殖[3]。FJX1基因还可以通过参与调节平面细胞极性(PCP)来增强癌细胞的侵袭，虽然PCP是伤口修复和发育的关键过程，它参与促进了原肠形成、神经管闭合等过程，该生物学过程的失调可能将导致癌细胞产生侵袭和转移的行为[3,22]。此外，FJX1基因表达还可以通过促进血管生成素等促血管生成基因的表达，诱导血管生成肽的产生来增强癌症进展[23]。

由于FJX1基因的关键致癌作用，靶向FJX1基因被认为是一种潜在的结直肠癌治疗策略。LIU等[24]的研究发现，抑制非编码RNA PVT1的表达可以通过靶向调控miR-106b-5p/FJX1信号轴，抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，为结直肠癌患者治疗策略的发展提供了新思路。此外，miR-532-3p[25]、miR-1249[26]均可以靶向调控FJX1基因表达，抑制结肠腺癌细胞的增殖和侵袭。因此可以推断，FJX1基因有希望成为结直肠癌潜在的分子标志物。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究是通过生物信息学的方法，综合多种数据库进行验证分析FJX1基因在结肠癌中的表达及对患者总体生存率的影响，初步揭示了FJX1基因在结肠癌中的分子意义。在分析患者的临床数据时，虽然排除了临床信息不完整、生存数据缺失的患者资料，但由于每位患者的情况不同，接受的临床治疗也存在差异，本研究是利用患者的随访数据初步显示了FJX1基因对结直肠癌预后的判断作用，结果可能存在偏倚。因此，在后续研究中仍需大标本的医学实验进一步验证。其次，通过基因富集分析指出了FJX1基因在致癌过程中的潜在分子作用机制，仍需要进行生物体内的医学实验进行验证。

综上所述，本研究显示FJX1基因在结肠癌组织中异常表达上调，与患者的恶性进展特征和不良预后相关。FJX1基因通过参与调节细胞黏附、细胞因子受体作用、ECM受体作用以及癌症相关信号途径促进了肿瘤的进展。FJX1基因可作为结肠癌患者的分子预后标志物和潜在的治疗靶点，这为进一步探讨FJX1基因在结肠癌中的生物学功能提供了线索和依据。