外周血单核细胞NLRP3在冠状动脉支架术后再狭窄患者中的表达水平及临床意义*

徐 为，罗 浩△，唐 辉

1.陆军军医大学大坪医院心血管内科，重庆 400042；2.重庆市双桥经济技术开发区人民医院心血管内科，重庆 400999

经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是阻塞性冠状动脉疾病最有效的治疗手段之一，可明显降低患者病死率并改善患者生活质量[1]。然而支架植入狭窄的冠状动脉管腔，虽然改善了心肌血供，但术后支架内再狭窄(ISR)仍不可避免，高达30%的裸金属支架(BMS)植入患者1年内会发生ISR，即使药物洗脱支架(DES)的使用显著减少了ISR的发生率，但临床研究发现其1年内ISR发生率仍在5%～10%[2]。ISR发生的原因在于球囊扩张和支架植入引起的血管内皮损伤，进一步促进血管平滑肌细胞表型转换(由收缩型转换为分泌型)，导致新生内膜形成[3]。该过程涉及众多机制，如细胞周期蛋白的激活或抑制、炎症反应、细胞凋亡、表观遗传学修饰等[4-5]。近年来相关研究显示，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体的激活与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关，通过抑制NLRP3炎性小体活性，可显著降低血管平滑肌细胞的增殖能力，改善斑块的稳定性[6]。对于ISR患者体内NLRP3炎性小体表达水平如何，目前尚无相关研究阐明。因此，本研究旨在观察外周血单核细胞NLRP3炎性小体在ISR患者体内的水平变化，探讨其与ISR发生的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入2018年1月至2020年1月在陆军军医大学大坪医院就诊并成功接受冠状动脉内DES植入术并在术后10～12个月行冠状动脉造影复查的患者215例，其中男122例、女93例，平均年龄(70.4±9.0)岁。纳入标准：所有患者均满足冠心病诊治指南[7]并达到冠状动脉支架植入标准；术后10～12个月在陆军军医大学大坪医院行冠状动脉造影复查；规律服用抗血小板及调脂药物；其中对于ISR患者，需满足ISR诊断标准，其定义为原支架内或支架两端5 mm内狭窄程度≥50%。排除标准：术中及术后1年内死亡的患者；严重肝肾功能不全；既往行冠状动脉旁路移植术；合并感染、自身免疫性疾病的患者。根据冠状动脉造影检查结果评估是否存在ISR，分为ISR组(52例)和非ISR组(163例)。该研究获得陆军军医大学大坪医院伦理委员会批准，并征得了患者家属知情同意。

1.2主要器械与试剂 人淋巴细胞分离液(上海生工生物工程有限公司)；离心机(美国Thermofisher公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)；反转录试剂盒(上海生工生物工程有限公司)；荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)。

1.3方法

1.3.1一般资料收集 收集患者一般资料，包括性别、年龄、体质量指数、吸烟史、家族史、基础疾病、冠心病分型、冠状动脉病变部位、冠状动脉病变支数、植入支架枚数及植入前后心肌梗死溶栓治疗(TIMI)分级。

1.3.2检测外周血单核细胞NLRP3 mRNA水平 入院当天收集患者外周血3 mL，置入乙二胺四乙酸抗凝管静置，按1∶1比例将人外周血与淋巴细胞分离液混合，在3 000 r/min转速下离心10 min，吸取中层白膜层细胞即为单核细胞。采用反转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测NLRP3 mRNA相对水平，首先提取总RNA进行反转录，NLRP3上游引物：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物：5′-GCTTCAGTCCCACACAGA-3′；内参GAPDH上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。建立20 μL反应体系，反应条件：预变性，95 ℃ 120 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；溶解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt方法计算NLRP3 mRNA相对水平。

2 结 果

2.1两组患者外周血单核细胞NLRP3 mRNA相对水平比较 ISR组外周血单核细胞NLRP3 mRNA相对水平为2.23±0.65，明显高于非ISR组的1.08±0.31，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2。

图1 两组患者外周血单核细胞NLRP3 mRNA相对水平比较

2.2两组一般资料比较 结果显示，ISR组与非ISR组在基础疾病糖尿病、高脂血症的比例，以及急性冠脉综合征、冠状动脉病变支数≥2支、植入支架枚数≥2枚、植入后TIMI分级>2级的比例比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组患者在性别、年龄、体质量指数及有吸烟史、有家族史、基础疾病高血压比例等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.3Logistic回归分析 以ISR发生为因变量，将2.1及2.2中差异有统计学意义的指标为自变量，行Logistic回归分析，结果显示患有糖尿病、植入支架枚数≥2枚、植入后TIMI分级≤2级及NLRP3 mRNA相对水平升高是ISR发生的独立危险因素(P<0.05)，见表2。

图2 两组患者外周血单核细胞NLRP3 mRNA表达差异的电泳图

表2 ISR发生的独立危险因素分析

2.4ROC曲线分析 ROC曲线分析表明，外周血单核细胞NLRP3 mRNA诊断ISR的AUC为0.778(95%CI：0.677～0.878)，最佳临界点为1.53，灵敏度和特异度分别为77.27%和61.29%，见图3。

图3 NLRP3 mRNA诊断ISR的ROC曲线分析

3 讨 论

冠心病是最常见的动脉粥样硬化疾病之一，对人民群众的生命健康构成严重威胁。目前，PCI是治疗冠心病的主要方法，但在PCI过程中，球囊对靶血管狭窄部位的扩张，可损伤内皮细胞，导致血小板在局部聚集，从而激活单核细胞黏附于内皮下，促进血管平滑肌细胞的增殖和泡沫化，导致新生内膜形成，这是引起ISR发生的重要原因之一[8]。目前，如何早期预测ISR的发生，对于其防治具有重要的临床意义。有研究显示，microRNA如miR-126、miR-224、载脂蛋白A及半胱氨酸等，与ISR形成具有一定相关性，是ISR发生的独立预测因素[9-10]。但上述指标的相关临床研究证据仍偏少，部分指标灵敏度或特异度偏低，无法有效预测ISR的形成。

支架内新生内膜增生的特点是血管内侧平滑肌细胞异常的增殖和迁移，导致支架局部管腔面积减少。既往研究表明炎症反应的激活参与了新生内膜的形成，抑制炎症反应如NLRP3、NF-κB通路，可显著减少小鼠颈动脉损伤和静脉移植后新生内膜形成[11-12]。在炎症激活的条件下，血管平滑肌细胞可分化为巨噬细胞，并伴有血管平滑肌细胞α-肌动蛋白表达的降低，表明炎症的激活可能在血管平滑肌细胞表型转换中发挥重要作用[13]。此外，巨噬细胞的增加可导致局部炎症和促进血管平滑肌细胞增殖效应的相关细胞因子如成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子等的合成与释放，从而进一步促进血管平滑肌细胞异常增殖[14]。外周血单核细胞的激活，是全身炎症反应的重要标志，有研究显示动脉粥样硬化患者单核细胞可显著激活，该激活程度与斑块的稳定性密切相关[15]。对于ISR患者，体内单核细胞NLRP3炎性小体表达水平如何，是否与ISR的发生相关，相关研究较少。本研究结果显示，与非ISR组比较，ISR组患者外周血单核细胞NLRP3 mRNA相对水平显著升高，提示ISR组患者体内NLRP3炎性小体处于激活状态。既往针对ISR发生的危险因素的相关研究较多，已有的研究发现血脂水平升高、合并糖尿病、冠状动脉病变重及吸烟等均可能是引起ISR发生的危险因素[16-17]。本研究结果显示：植入支架枚数≥2枚、植入后TIMI分级≤2级及NLRP3 mRNA相对水平升高是ISR发生的独立危险因素；而高血脂、吸烟等因素，虽然在ISR和非ISR组间存在差异，但上述因素并不是ISR发生的独立危险因素，与张春艳等[18]研究存在一定差异，其原因可能与回顾性分析的样本量、回访就诊的时间等差异有关。进一步评估外周血单核细胞NLRP3 mRNA水平诊断ISR的价值，通过ROC曲线分析显示，其对ISR的诊断价值较高，同时具有较高的灵敏度和特异度。NLRP3作为一项生化指标，对ISR患者早期评估，显示出了较强的临床运用前景。NLRP3炎性小体激活是ISR发生的独立危险因素，这可能与NLRP3的激活可促进下游炎性因子IL-1β水平的增加，IL-1β可招募中性粒细胞、细胞内黏附分子-1等至受损血管内皮处，致使血管通透性增加，同时还可增加纤溶酶激活物抑制物1和纤维蛋白原水平，促进血栓形成等有关[19]。

综上所述，本研究结果显示，外周血单核细胞NLRP3炎性小体的激活是ISR发生的独立危险因素，通过检测患者外周血单核细胞NLRP3 mRNA相对水平，对ISR发生的早期预测具有一定临床价值。本研究局限性：(1)单核细胞NLRP3炎性小体及下游相关通路的激活及调控机制目前未充分阐明，如何调控并靶向抑制NLRP3炎性小体，是下一步研究的方向；(2)本研究回顾性分析的病例量偏少，可能会对研究结果产生影响。