AHP法结合Box-Benhnken试验优化伤科喷膜剂提取工艺

许慧春，邹福贤，黄秋萍，褚克丹，李 煌

(1.福建中医药大学附属泉州市正骨医院，福建 泉州 362000；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)

伤科喷膜剂处方来源于泉州市正骨医院老中医经验方伤科搽剂，为泉州市正骨医院的院内制剂(闽药制备字Z20200034000)，由黄连、大黄、红花、延胡索、胡黄连、蟾酥、夹竹桃和冰片组成，方中黄连具有清热燥湿、泻火解毒的功效，为君药；臣药大黄、延胡索、红花和胡黄连；佐药蟾酥；使药冰片；诸药合用，发挥清热解毒、活血袪瘀、消肿止痛等功效。伤科搽剂广泛应用于骨折脱位及软组织损伤后局部肿胀疼痛，但因患者依从性问题，使用不便，故拟将其开发为喷膜剂，为保证疗效及后期质量的稳定可控，因此对前期的提取工艺进行优化。中药复方制剂通过多组分、多靶点发挥疗效，因此在前期的提取工艺优化时需要考虑多个有效成分的含量。多属性决策是指在同时考虑多个属性情况下，优选最佳方案，非常适合于中药及复方制剂的研究，其中层次分析法(AHP)结合主观意愿和客观分析进行权重系数计算，是目前中药领域常见的决策分析方法之一[1]。响应面分析法可用于一个或多个响应值与几种因素的交互作用，其中Box-Behnken设计所需试验次数少、效率高[2]。将AHP法与响应面法结合可获得更能体现复方制剂质量的提取工艺，目前已有报道运用此法获得养阴清肺汤、连翘提取工艺和复方肉苁蓉合剂提取工艺等[3-5]，该工艺较为成熟、简便。

本研究通过单因素考察，确定影响提取率的因素及其范围，采用Box-Behnken对试验进行工艺优化，以AHP法获得的各指标权重值进行综合评价，最后应用响应面模型对试验数据进行分析和训练，并进行预测和验证，以获得最佳提取工艺条件，为伤科喷膜剂的研发提供参考资料和数据支撑，为后期的临床研究服务，并最终造福广大患者。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CPA225D型1/10 万分析天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q 超纯水(美国Millipore 公司)；Agilent 1100 高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。

1.2 材料

试验所用饮片购自安徽亳州聚草中药饮片有限公司；盐酸小檗碱对照品(批号：110713-202015)，胡黄连苷II(批号：111596-201805)均购自中国食品药品检定研究院；羟基红花黄色素A(批号：MUST-20080111)购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈(色谱级)购自国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～3 min，15%～20% A；3～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～25% A，25～30 min，25%～55% A)；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；VWD检测器(检测波长：0～10 min，403 nm；10～20 min，280 nm；20～30 min，345 nm)；进样量：10 μL。

2.1.2 对照品溶液配制 精密称取盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II对照品适量，至10 mL容量瓶中，加入纯甲醇溶解后定容，分别获得浓度为738 μg/mL、555 μg/mL、946 μg/mL的对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液制备 称取组方中各饮片，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入适量一定浓度的乙醇，回流提取。取适量提取液稀释2.5倍，过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。

2.1.4 阴性供试品制备 分别称取去除黄连、红花和胡黄连之外的饮片，按“2.1.3”项方法制备供试品溶液，结果见图1。

注：1.羟基红花黄色素A；2.胡黄连苷II；3.盐酸小檗碱；A.标准品图；B.供试品图；C.缺红花阴性图；D.缺胡黄连阴性图；E.缺黄连阴性图。

2.1.5 标准曲线制备 精密吸取盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II对照品溶液适量，配制成浓度分别为177.12、113.52、333 μg/mL的混合对照品溶液，并用甲醇稀释成多个梯度的混合对照品，按“2.1.1”项下色谱条件进样，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 标准曲线结果

2.1.6 专属性试验 精密吸取供试品溶液、阴性供试品溶液和混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，结果见图1。由图1可知各目标峰分离度和对称因子均符合要求，塔板数均>20 000，并且无干扰，表明专属性良好。

2.1.7 精密度试验 精密吸取供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II的峰面积RSD分别为0.11%、0.09%和0.61%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验 称取6份处方，按“2.1.3”项制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，将峰面积代入标准曲线中计算含量，结果盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II含量的RSD分别为1.45%、1.73%和1.68%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12和24 h，按“2.1.1”项下色谱条件进样，结果盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II峰面积的RSD分别为1.93%、1.94%和2.98%，表明供试品溶液在24 h内较为稳定。

2.1.10 加样回收率试验 采用已知含量的饮片，称取处方量的一半，加入盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II适量，平行操作6份，按“2.1.3”项制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，结果盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II的加样回收率分别为96.38%、98.59%和101.50%，RSD分别为1.43%、3.45%和4.22%，表明该方法准确度高。

2.2 综合评价指标计算

采用1～9标度法对盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II进行两两比较，评价各指标的相对重要性，再按几何平均法(根法)计算各指标的权重系数，得到盐酸小檗碱、羟基红花黄色素A和胡黄连苷II的权重系数分别为0.649、0.279、0.072。对各权重系数进行一致性检验，CI(一致性指标)=0.047≠0，CR(随机一致性比率)=0.081<0.1，说明指标的权重通过一致性检验[6]，数据有效。因此综合评分=(盐酸小檗碱含量/盐酸小檗碱最大含量)×0.649+(羟基红花黄色素A含量/羟基红花黄色素A最大含量)×0.279+(胡黄连苷II含量/胡黄连苷II最大含量)×0.072。

2.3 单因素试验

2.3.1 溶剂浓度考察 称取组方各饮片，按10倍量(mL/g)分别加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇，均提取1次，提取时间60 min。按“2.1.5”项计算含量和综合评分。结果发现综合评分随溶剂溶度的增大而先增后减，60%时的评分最高。结果见图2。

图2 溶剂浓度考察综合指标评分

2.3.2 提取时间考察 称取组方各饮片，按10倍量(mL/g)加入60%乙醇，均提取1次，分别提取30 min、60 min和90 min。按“2.1.5”项计算含量和综合评分。结果发现综合评分随提取时间的增加而逐渐增加，变化较为平缓，说明提取时间因素对有效成分的溶出影响较小。结果见图3。

图3 提取时间考察综合指标评分

2.3.3 提取次数考察 称取组方各饮片，按10倍量加入60%乙醇，分别提取1次、2次和3次，提取时间60 min。按“2.1.5”项计算含量和综合评分。结果发现提取2次和3次的综合评分显著高于提取1次的，提取3次的评分略高于提取2次的，考虑时间和溶剂等因素，最终确定提取次数为2次。结果见图4。

图4 提取次数考察综合指标评分

2.3.4 提取倍量考察 称取组方各饮片，分别加入6、8、10、12、14、16倍量(mL/g)的60%乙醇，均提取1次，提取时间60 min。按“2.1.5”项计算含量和综合评分。结果发现综合评分随倍量的增大而先增后减，在12～16倍之间变化较为缓慢，14倍量时的评分最高。结果见图5。

图5 提取倍量考察综合指标评分

2.4 响应面法优化工艺

2.4.1 响应面试验设计 响应面分析法是一种用于在多因素系统中寻找最佳测试条件的统计方法。在单因素考察结果的基础上选取溶剂浓度、提取时间和料液比作为三因素，提取次数固定为2次，以综合评分作为指标，根据Box-Benhnken设计17组试验，结果见表2。

表2 响应面法设计方案及试验结果

表3 响应面二次回归方程方差分析

2.4.2 响应面结果分析 运用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行二次多项式回归拟合，对提取时间(A)、溶剂浓度(B)、提取倍量(C)的综合评分回归模型方程为：综合评分=-26.347 71+0.214 59×A+2.527 87×B+7.986 10×C+1.621 97×10-3×AB+7.920 40×10-3×AC-2.761 79×10-3×BC-3.045 32×10-3×A2-0.024 553×B2-0.328 30×C2(R2=0.922 0)。回归方程各项方差分析中F检验可以判断自变量对因变量的影响，由此得到各因素对综合评分影响的主次顺序为溶剂浓度>提取倍量>提取时间。回归方程和方差分析还表明，模型中一次项溶剂浓度对综合评分的影响达到极显著水平(P<0.01)，提取倍量、提取时间对综合评分具有显著影响(P<0.05)；模型中二次项A2和C2对综合评分的影响达到显著水平(P<0.05)。

响应面图形是响应值对各试验因素A、B、C所构成的三维空间的曲面图，在其他试验因素固定不变的情况下，考察交互项对得率的影响，响应面分析图可用于评价试验因素对综合评分影响的两两交互作用，响应面坡度越陡峭，表明响应值对于操作条件的改变越敏感，该因素对综合评分的影响越大；反之则表明因素对综合评分的影响越小，结果见图6。当提取倍量一定时，综合评分随着提取时间的增加呈现出先增后减的趋势，随着溶剂浓度的增加呈现略增加随即减小的趋势；当溶剂浓度一定时，综合评分随着提取倍量和提取时间的增加呈现出先增后减的趋势；同样提取时间一定时，综合评分随着提取倍量和溶剂浓度的增加呈现出略增加后随即减小的趋势。通过分析三者的交互作用，发现因素溶剂浓度与提取倍量的相互作用对综合评分的影响最大。

图6 各因素之间两两相互作用三维曲面图

2.5 最佳工艺条件验证

通过响应面模型优化后的提取条件：提取时间65.88 min、溶剂浓度52.93%、提取倍量12.73(mL/g)，并根据实际情况对提取工艺进行验证试验。采用12.7倍量的53%乙醇回流提取66 min，共提取2次，分别进行了3次重复试验，按“2.1.1”项下色谱条件进样，计算综合评分，结果分别为98.57、98.67和99.39，平均98.87，与理论值98.48误差为0.4%，证明响应面模型优化伤科喷膜剂提取工艺方法较为可靠可行。

3 讨论

3.1 指标性成分选择

根据《中国药典》2020版，本方组成在药典中的指标性成分主要有盐酸小檗碱、胡黄连苷I、胡黄连苷II、羟基红花黄色素A、延胡索乙素、大黄酸等蒽醌类成分[7]。通过前期预实验发现在10倍量提取后，延胡索乙素、大黄酸等蒽醌类成分检测限较低，不适于提取工艺优化的指标选择；剩余成分含量较高，并且分别来源于君药黄连、臣药红花和佐药胡黄连，其中盐酸小檗碱和胡黄连苷II具有抗炎、抗病原微生物的作用[8- 9]，羟基红花黄色素A为红花黄色素中活血化瘀成分的最有效部分[10]。因此选择盐酸小檗碱、胡黄连苷II、羟基红花黄色素A作为提取工艺考察的指标成分。

3.2 色谱条件优化

色谱条件在前期优化过程中分别考察流动相组成比例、色谱柱温度和流速等因素对目标峰的影响情况。有机相通过比较乙腈和甲醇，发现乙腈作为有机相，洗脱能力更强，使得图谱噪音更低，峰型更为对称[10]。关于水相，考察酸性对其的影响，发现加入酸水后，盐酸小檗碱峰型更为尖锐，减少脱尾情况，而其中又以0.2%磷酸水效果最好。因此，选择乙腈-0.2%磷酸水作为流动相。在柱温和流速的考察上，30、35、40 ℃不同柱温以及0.8、1.0、1.2 mL/min对样品峰形、保留时间、分离度的影响均较大，可根据色谱峰型和分离度的情况做出选择。因此，本试验选择了乙腈-0.2%磷酸水作为流动相，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min作为本次实验的色谱条件。

本试验以提取时间、提取次数、提取溶剂和提取倍量为考察因素，结合HPLC测定羟基红花黄色素A、胡黄连苷II和盐酸小檗碱的含量，通过AHP法计算出各指标的权重值，并将综合评价值作为评价指标，采用响应面法优化出最佳提取工艺为：12.7倍量的53%乙醇回流提取66 min，提取2次。三批工艺验证结果表明该工艺可行、稳定性好，可为伤科喷膜剂的批量生产提供参考。