益生菌冲剂的体外模拟消化及抗菌活性研究

莫景康，苏可盈，黎绍基

（广州工商学院，广东广州 510000）

益生菌是与人体形成共生关系并对人体健康有利的微生物，被广泛应用于食品和医药领域[1-3]。常见的益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌以及球菌等[4]。益生菌在肠道内可以产生分解酶，分解肠道中游离的氨类以及吲哚等有害物质，降低有害物质对身体的侵蚀。益生菌不仅能够促进消化吸收、增强身体免疫力、缓解过敏反应等，还具有预防癌症以及降低胆固醇的功能，能够产生抑制肿瘤生长的代谢产物，激活免疫系统将致癌菌、肠毒素等排出体外，减少癌症发病率，还可以通过同化作用抑制胆固醇合成，减少人体对胆固醇的吸收，维护肠道健康[5-6]。此外，益生菌对肠道病原体也有抑制作用[7]。大肠杆菌是重要的肠道病原体，益生菌的抑菌活性是衡量益生菌产品的重要指标。

体外消化模型可用于模拟人体肠道消化的真实生理环境，通过控制实验物质的投放，观察和干预实验物质的消化情况和相互作用。体外消化模型可以分为静态模型、动态模型等[8-9]，其中静态模型制作简单，应用最为广泛[10]。张林奇等[11]利用体外肠道模型对6种益生菌粉进行模拟消化的耐受性分析，发现6种益生菌粉与标识均存在差异。

益生菌的抑菌作用是其重要功能，其在肠道中的活性对其发挥益生作用至关重要。本文研究了益生菌冲剂中的益生菌对大肠杆菌的抑菌作用，并通过静态体外消化模型研究了益生菌冲剂中的益生菌在经过胃肠道消化后的活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MRS固体培养基、猪胆盐，北京奥博星生物技术有限公司；胰酶、胃蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司；MRS液体培养基，杭州百思生物技术有限公司；ATCC2592大肠埃希氏菌（大肠杆菌），上海保藏生物技术中心。

3种益生菌冲剂产品（A、B、C）中的益生菌信息见表1。

表1 实验用益生菌冲剂信息

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

将有效期内的3种益生菌冲剂产品中的益生菌接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养活化，每24 h传代。实验时将细菌培养液于4 000 r·min-1离心10 min，去掉上清液，用生理盐水悬浮，重复以上离心、悬浮、离心步骤，最后用新鲜的MRS液体培养基悬浮并稀释至所需浓度。

1.2.2 活菌计数

活菌计数依据国家标准《食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016）[12]和张林奇等[11]所述的乳杆菌和嗜热链球菌计数方法。活菌数达成率为实际活菌数占标称活菌数的百分比。

1.2.3 大肠杆菌抑菌活性的测定

大肠杆菌抑菌活性的测定方法借鉴参考文献[7]的方法。将大肠杆菌均匀分布于MRS固体培养基表面，取直径为6 mm的灭菌小圆纸片，蘸取微量益生菌培养液（3种产品益生菌接种浓度统一为2.5×107CFU·mL-1）置于培养基表面，密封膜密封后倒置放入37 ℃培养箱培养72 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径，对比3种产品中益生菌的抑菌能力。

1.2.4 体外模拟胃肠道消化

（1）人工胃液和肠液的配制。配制方法参照文献[13]，具体有以下几方面。①人工胃液的配制。取稀盐酸（6 mol·L-1）16.4 mL，加入800 mL去离子水搅拌混合。调pH值至2.5，将其倒入1 000 mL容量瓶，加入去离子水定容。高压灭菌后冷却至室温，加入10 g胃蛋白酶，搅拌至完全溶解。②人工肠液的配制。称取6.8 g磷酸二氢钾，加入500 mL去离子水搅拌至溶解。用氢氧化钠（0.1 mol·L-1）调节pH值至6.8，继续加入去离子水定容至1 L，高压灭菌后冷却至室温，加入猪胆盐3 g，胰蛋白酶10 g，充分搅拌至完全溶解。

（2）3种益生菌冲剂活性的测定。通过体外模拟胃肠道消化测定3种益生菌冲剂的活性。将1 mL浓度为7.5×107CFU·mL-1的菌液加至20 mL人工胃液中，密封，并于37 ℃中以90 r·min-1恒温摇荡培养1 h，然后加入80 mL人工肠液，密封后再放入37 ℃振荡机中，120 r·min-1继续摇荡培养2 h。以接种菌液的MRS液体培养基为阳性对照，以无接种菌液的人工胃、肠液为阴性对照。培养后取1 mL菌悬液用PBS缓冲液（pH 7.2）进行梯度稀释，平板培养后进行活菌计数，并按公式（1）计算存活率。

式中：Ni为ih后的活菌数；N0为初始活菌数。

2 结果与分析

2.1 活菌数情况

如表2所示，3种益生菌冲剂的活菌数存在较大差异，3种产品活菌数均超过1×106CFU·g-1，但均未达到产品标称活菌数。其中A产品的活菌数达成率最高。

表2 3种益生菌冲剂菌落生长情况

2.2 抑菌活性

如表3所示，3种产品中的益生菌都表现出了对大肠杆菌的抑制能力，且抑菌能力的排序为C＞A＞B。说明3种益生菌产品都能在大肠杆菌大量存活的大肠环境中存活，且具有一定的抑菌活性。

表3 3种益生菌产品对大肠杆菌抑菌能力

2.3 模拟消化

3种益生菌冲剂产品经模拟消化后，仅有A产品具有存活能力（0.000 04%）；B、C产品并没有生长繁殖。表明在经过体外模拟消化后，大多数益生菌被胃肠液消化导致失活，仅有极少数能成功生长并繁殖，详见表4。

表4 3种益生菌产品体外模拟消化后的活性

3 结论

本研究利用大肠杆菌测试3种产品益生菌的抑菌能力，可发现3种产品益生菌都有表现出对大肠杆菌的抑菌能力。经模拟胃肠道消化后，3种益生菌产品仅有A产品的益生菌有少量存活。如何提高产品益生菌的耐消化活性是各个厂家研发人员需要重点解决的问题。本研究对益生菌冲剂产品的探究，能为市场监管部门提供数据支撑，也能帮助企业开发出更好的同类产品。