金荞麦提取物对百草枯中毒大鼠急性肺损伤和MAPK/NF-κB信号通路的影响

陈永生，付 斌，郑永先

(海口市人民医院 急诊医学部，海南 海口 570208)

百草枯(Paraquat,PQ)是一种全世界广泛使用的非选择性季胺类除草剂，具有价格低廉、除草效能高等优点[1]，但其能够通过人畜皮肤接触和呼吸道吸入等方式造成急性中毒，导致全身性器官衰竭。PQ中毒致死剂量极低，因而致死率极高[2]。肺是PQ中毒的靶器官，PQ进入体内，选择性地在肺中聚集，募集大量炎性细胞浸润、诱导氧化应激反应与脂质过氧化反应发生，最终引起急性肺损伤、肺水肿和肺纤维化，导致患者死亡[3]。由于PQ中毒急且迅速，目前没有特效药，急性肺损伤以及抗炎抗氧化治疗药物对PQ中毒效果不够理想，且PQ中毒事故频发，寻找PQ中毒特效药物已成为主流。研究发现，氧化应激和炎症反应是PQ中毒急性肺损伤的主要病理机制，而丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)/核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路是氧化应激与炎症反应过程中的关键传导途径，下调p38MAPK/NF-κB通路表达，可显著降低PQ中毒大鼠炎症反应程度，保护受损肺组织[4]。金荞麦(Fagopyri dibotryis rhizoma,FDR)是一种临床常用的中药，具有抗炎、抗氧化、抗病毒以及改善肺纤维化、止咳平喘的作用，在慢性阻塞性肺疾病中能够显著下调NF-κB的表达，抑制炎症反应发生，保护肺组织[5]。FDR主要包括黄酮类、多酚类以及有机酸等化学成分，研究发现，FDR提取物可能通过MAPK信号通路治疗糖尿病肺病[6]，但其在PQ中毒肺损伤大鼠中的研究尚少。本实验通过建立PQ中毒致大鼠急性肺损伤模型，探究FDR提取物调控MAPK/NF-κB信号通路，保护大鼠肺损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，6周龄，体重200～220 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK(浙)2019-0001，动物质量许可证号为110322211100491267。饲养条件：温度为22～25℃，湿度为45%～50%，自由采食饮水。本研究实验过程均符合伦理要求。

1.2 实验药物与试剂 20% PQ水剂(SNA8F03206)购自江苏先正达南通农作物保护有限公司；FDR提取物(纯度99%，每克相当于生药20 g)购自陕西斯诺特生物公司；地塞米松(A1746,100 mg,纯度≥98%)购自北京康纳瑞生物技术有限公司；SOD(A001-3-2)、MDA(A003-1-2)检测试剂盒及IL-1β(H002)、TNF-α(H052-1)ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；HE染色试剂盒(G1120)、Masson染色试剂盒(G1340)、RIPA高效蛋白裂解液(R0010)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)均购自北京索莱宝生物技术有限公司；ERK(9102S)、p-ERK(9101S)、JNK(9252S)、p-JNK(4668S)、p38MAPK(9212S)、p-p38MAPK(9215S)、p-NF-κB(3031S)、NF-κB(8242S)一抗、β-actin(4967S)、羊抗兔二抗(HRP,7074S)均购自美国CST公司。CollagenⅠ(ab270993)、CollagenⅢ(ab6310)一抗、羊抗小鼠二抗(ab6789)均购自英国Abcam公司。

1.3 实验仪器 Premier3500全自动血气分析仪(美国GEM公司)；OlympusBX53-P光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；JY04S-3D凝胶成像分析系统(北京君意华鑫科技有限公司)；Thermo 微量离心机Heraeus Fresco 21(美国ThermoFisher公司)；MiniProTMEpPlus增强型电泳仪电源(上海翌圣生物科技股份有限公司)。

1.4 模型建立与分组 给药将50只SD大鼠固定，一次性腹腔注射20% PQ水剂30 mg/kg建立PQ中毒大鼠急性肺损伤模型[7]，且造模过程中未见大鼠死亡。造模成功后随机分为模型组、阳性对照组、FDR-L、FDR-M、FDR-H组，其中阳性对照组腹腔注射地塞米松2.5 mg/kg[8]，FDR-L、FDR-M、FDR-H组分别灌胃给予140、280、560 mg/kg[9]金荞麦提取物，每天1次，连续给药3 d。另取10只大鼠不进行PQ水剂注射，仅灌胃等体积生理盐水，作为正常组。

1.5 动脉血PaO2、PaCO2的检测 给药结束24 h后麻醉大鼠，收集大鼠颈动脉血，迅速采用全自动血气分析仪对动脉血PaO2、PaCO2进行检测。

1.6 血清氧化应激指标、炎性 因子水平的检测收集动脉血，1 200×g离心15 min，分离血清，按照试剂盒说明书严格进行操作，检测SOD活性与MDA、IL-1β、TNF-α水平。

1.7 苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)观察肺组织病理学变化大鼠 麻醉取血后将其断头处死，分离肺组织，4%多聚甲醛固定，采用常规酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片，进行HE染色。光镜下观察肺组织病理学变化。对肺泡充血、组织出血、中性粒细胞浸润以及肺泡壁增厚这4个方面进行组织损伤评分，其中未见损伤：0分；轻度损伤：1分；中度损伤：2分；重度损伤：3分；极重损伤：4分。以各项指标评分总和为最终组织损伤评分。

1.8 Masson染色观察肺组织纤维化程度 取“1.7项”制备好的肺组织切片，脱蜡水化后，采用苏木精染色，再使用酸性乙醇分化液进行分化，流动水冲洗，Masson蓝化液返蓝，冲洗后采用品红染色，磷钼酸、弱酸溶液浸洗，苯胺蓝染色后再次使用弱酸溶液浸洗，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片，光学显微镜下观察大鼠肺组织纤维化程度。

1.9 免疫组化法检测肺组织中 CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达取“1.7项”中制备好的肺组织切片，过氧化氢酶修复抗原后加入胰酶消化，于37 ℃ 5%山羊血清中封闭1 h，加入1∶100稀释的CollagenⅠ、CollagenⅢ一抗，4℃孵育过夜，再加入1∶100稀释的二抗，37 ℃孵育1 h，采用DAB显色，苏木精复染，脱水封片，显微镜下观察，以棕色为阳性表达，使用Image J软件分析积分光密度(整个视野内所有阳性细胞反应强度的总和)作为目的蛋白的相对表达。

1.10 Western blotting法检测肺组织MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白的表达 采用RIPA高效蛋白裂解液提取大鼠肺组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量。取20 μg蛋白上样，行电泳、转膜等操作，5%BSA封闭2 h，TBST洗膜，加入1∶1 000稀释的p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38MAPK、p38MAPK、p-NF-κB、NF-κB一抗孵育液，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入1∶1 000稀释的二抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜，采用ECL发光检测，凝胶成像分析系统扫描图像，分析灰度值，以β-actin为内参，计算p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值。

2 结果

2.1 各组大鼠动脉血气指标的变化 与正常组比较，模型组大鼠PaO2下降、PaCO2升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组与FDR各剂量组大鼠PaO2升高、PaCO2下降(P<0.05)，其中FDR各剂量组具有剂量依赖效应(P<0.05)；与阳性对照组比较，FDR-H组上述指标差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 各组大鼠动脉血中PaO2、PaCO2的比较

2.2 各组大鼠血清中SOD活性 与MDA、IL-1β、TNF-α水平的变化与正常组比较，模型组大鼠血清中MDA、IL-1β、TNF-α水平升高，SOD活性降低(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组与FDR各剂量组大鼠血清中MDA、IL-1β、TNF-α水平降低，SOD活性升高(P<0.05)，且FDR各剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，FDR-H组大鼠血清中上述指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清中SOD活性与MDA、IL-1β、TNF-α水平的比较

2.3 各组大鼠肺组织病理学变化 大鼠肺组织病理切片HE染色结果显示，正常组大鼠肺组织结构清晰，肺泡间隔正常，未见中性粒细胞浸润；模型组大鼠肺组织病变严重，肺泡被大量破坏，肺泡壁增厚，中性粒细胞大量浸润，视野中可见大量病灶，肺损伤评分显著升高(P<0.05)；阳性对照组以及FDR各剂量组肺组织病理损伤显著减轻(P<0.05)，炎性因子浸润现象减少，肺组织评分降低；其中FDR各剂量组间具有剂量效应(P<0.05)。阳性对照组与FDR-H组肺组织病理损伤表现更轻，且两组肺组织损伤评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1、表3。

A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：FDR-L组；E：FDR-M组；F：FDR-H组；HE：×200。

表3 各组大鼠肺组织评分比较

2.4 各组大鼠肺组织纤维化情况 Masson染色结果显示，正常组大鼠肺组织结构清晰，未见纤维化；模型组大鼠肺组织明显纤维化；与模型组比较，阳性对照组与FDR各剂量组肺组织纤维化程度明显减轻，其中FDR各剂量组具有剂量依赖效应；阳性对照组与FDR-H组肺组织纤维化程度最轻(见图2)。

A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：FDR-L组；E：FDR-M组；F：FDR-H组；Masson：×200。

2.5 各组大鼠肺组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达 与正常组比较，模型组大鼠肺组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组与FDR各剂量组大鼠肺组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ表达均降低(P<0.05)，其中FDR各剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，FDR-L组、FDR-M组大鼠肺组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ表达均升高(P<0.05)，FDR-H组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)，见图3、表4。

A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：FDR-L组；E：FDR-M组；F：FDR-H组；×400。

表4 各组小鼠肺组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ表达的比较

2.6 各组大鼠肺组织中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达的变化 与正常组比较，模型组大鼠肺组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值均升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组与FDR各剂量组大鼠肺组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值均降低(P<0.05)，其中FDR各剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：FDR-L组；E：FDR-M组；F：FDR-H组。a：与正常组比较，P<0.05；b：与模型组比较，P<0.05；c：与阳性对照组比较，P<0.05；d：与FDR-L组比较，P<0.05；e：与FDR-M组比较，P<0.05。

3 讨论

PQ中毒事故在全世界范围内频发，其致死量小，发病迅猛，加之肺可主动吸收外界摄入的PQ导致肺组织受损程度远大于其他器官[10]。目前研究认为，PQ中毒引起急性肺损伤的主要原因是PQ诱导氧自由基的产生，引发氧化应激与脂质过氧化反应过程[11]，由于PQ具有强烈刺激性与腐蚀性，能够直接破坏细胞结构并募集炎性细胞，引起全身性炎症反应的发生[12]，最终导致肺组织发生不可逆的纤维化反应。本研究结果亦证实了这一结果：PQ中毒致急性肺损伤模型大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平升高，炎症反应被激活；MDA水平升高，SOD活性下降，提示过氧化反应发生；肺组织受损严重，肺泡壁增厚，大量炎性细胞浸润，肺组织发生明显纤维化反应。

FDR黄酮具有很强的清除氧自由基的功能，能够抑制糖脂代谢与氧化应激水平[13]。本研究发现，FDR能够有效减轻PQ中毒致急性肺损伤大鼠肺组织病理损伤，下调MDA水平，上调SOD活性，抑制氧化应激反应；另外，还能够降低IL-1β、TNF-α表达，减轻炎症反应，下调CollagenⅠ、CollagenⅢ表达，从而改善肺组织纤维化，保护肺损伤。本实验结果表明，FDR在疾病中具有剂量依赖性，其高剂量组抑制氧化应激以及抗炎作用与地塞米松效果一致，但其具体调控机制尚不明确。

MAPK是一类重要的蛋白激酶家族，主要包括p38MAPK、ERK和JNK3种平行通路，在机体中参与细胞增殖、分化以及凋亡等生理过程[14]。p38MAPK信号通路在肺损伤的炎症反应及细胞凋亡过程中发挥重要作用，NF-κB是其下游因子，参与诱导促炎因子的表达以及细胞凋亡、分化[15-16]。本研究结果显示，PQ中毒大鼠肺组织中p38MAPK、ERK和JNK磷酸化表达上调同时NF-κB磷酸化表达上调，提示MAPK/NF-κB通路被激活，加大炎症反应的发生，加重肺组织损伤。而FDR干预后的肺损伤大鼠肺组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB均明显降低，提示FDR能够下调p38MAPK、ERK、JNK和NF-κB磷酸化表达，抑制MAPK/NF-κB通路激活，发挥抗炎、抗氧化应激作用。

综上所述，FDR能够有效抑制MAPK/NF-κB信号通路的激活，并通过抑制氧化应激、减轻炎症反应，发挥改善肺纤维化，保护肺损伤的作用，为临床上使用FDR减轻PQ中毒导致的肺损伤提供了新的理论依据。由于PQ中毒发病机制复杂，反应通路多样，具体机制仍需进一步探索。