亚甲基四氢叶酸脱氢酶2与肿瘤表型关系的研究进展

黄美慧，许圳南，薛家健，杜则澎，许海雄，刘明发，*

(1．汕头市中心医院中心实验室，广东 汕头 515031；2．汕头市中心医院神经外科，广东 汕头515031)

恶性肿瘤的发生与发展，是多基因、多种信号通路以及细胞代谢改变等多因素共同参与导致的一种病理改变，死亡率较高，严重威胁着人民群众的生命健康。肿瘤细胞处于快速分裂增殖过程，对于能量的需求明显高于正常组织，因而肿瘤细胞可以通过改变自身代谢过程来适应生存。众所周知，一碳代谢的异常可以满足肿瘤细胞对高增殖率和生存的需求[1]。一碳代谢包括叶酸循环和甲硫氨酸循环，可以产生一碳单位，用于核苷酸的合成、DNA甲基化反应和还原性代谢过程。

亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，MTHFD2)属于MTHFD家族(包含MTHFD1L、MTHFD1、MTHFD2L和MTHFD2)的成员，在腹水肿瘤细胞中首次被发现，不同于胞质中以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为辅酶的MTHFD1，MTHFD2主要依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)[2]。MTHFD2由 一 个功能性前体失去合成酶的结构域形成[3]，具有亚甲基四氢叶酸脱氢酶和甲基四氢叶酸环化水解酶的双重酶活性，在线粒体一碳代谢途径中，可以将亚甲基四氢叶酸氧化为10-甲酰四氢叶酸[4]。在快速增殖的细胞中，MTHFD2活性较高，与叶酸代谢等途径中的其他分子共同表达升高，使嘌呤、三磷酸腺苷、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的含量增加，从而促进细胞的快速增殖[5]。Nilsson等[6]分析了19种癌症(共1 981例人类肿瘤样本)的表达谱，发现MTHFD2是1 454种代谢酶中表达上调最为稳定的酶，这些均提示了MTHFD2在恶性肿瘤中可能发挥重要的生物学功能。因此，本文就MTHFD2在肿瘤细胞增殖、迁移侵袭、死亡及其临床意义等方面的相关研究进展进行综述。

1 MTHFD2的结构、定位及表达

人类MTHFD2(别名NMDMC)基因定位于2p13.1染色体，基因全长16 736 bp，含9个外显子，8个内含子。MTHFD2蛋白由350个氨基酸构成，相对分子质量约为37 kD。MTHFD2为二聚体结构，其X-射线晶体结构显示，该蛋白由两个长α螺旋连接两个结构域组成，并由一个小的D2螺旋在两结构域之间形成一个大缝隙，配体的结合位点则位于大缝隙中[7]。可结合的配体包括NAD+、无机磷酸盐和LY345899。

MTHFD2主要定位在线粒体，在线粒体中发挥脱氢酶活性作用，为核苷酸合成和其他甲基化反应提供一碳单位[8]。而Sheppard等[9]通过亚细胞分离技术发现，MTHFD2还可以定位在细胞核，且与DNA复制位点相同；Liu等[10]同样证实了MTHFD2可以定位于细胞核，并参与细胞周期调控，但是对于细胞核内MTHFD2发挥的更多潜在功能仍不清楚。

值得注意的是，MTHFD2在胚胎发育过程中表达，在大多数正常成人组织中很少或者不表达[4]，但MTHFD2在乳腺癌、肺癌、卵巢癌和结直肠癌等恶性肿瘤中较正常癌旁组织的表达均升高[11-14]，且与这些肿瘤的预后不良密切相关。Koufaris等[15]研究者利用放线菌酮处理细胞，验证了MTHFD2的半衰期明显低于其他一碳代谢酶；另外，MTHFD2可被生长因子诱导表达。所以理论上MTHFD2抑制剂的作用相比于其他一碳代谢途径抑制剂如甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)更具有选择性[16]，MTHFD2可能是癌症治疗的安全靶标[17]。

2 MTHFD2与肿瘤表型关系的研究

恶性肿瘤具有持续性增殖、异常信号通路激活、凋亡减弱、细胞能量异常、基因组不稳定、持续的血管生成、组织的浸润与转移等表型特征，其中一碳代谢的异常可显著影响肿瘤细胞的恶性表型[1]。近年来，研究表明MTHFD2在多种肿瘤比如乳腺癌、肝癌和结直肠癌中表达上调，且在肿瘤中能够作为独立预后因子，与预后不良相关。此外，MTHFD2表达的缺失，可以消除肿瘤的恶性表型，如增殖、迁移、侵袭和转移等[18]。值得探讨的是，本课题组研究MTHFD2在恶性胶质瘤中的生物学功能及机制时，发现MTHFD2可能与恶性胶质瘤细胞的迁移、侵袭和增殖等生物学功能密切相关(数据待发表)。

2.1 MTHFD2与细胞增殖

肿瘤细胞的持续性增殖能力，是肿瘤恶性进展的指标之一，临床中常用的TNM分期中的T是指肿瘤的大小。Huang等[11]利用报告基因和集落形成等实验技术发现，乳腺癌MCF-7细胞中MTHFD2显著过表达后，蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)活性增强进而促进MCF-7细胞的增殖和集落形成。而Lehtinen等[19]则发现，MTHFD2对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖并不产生明显影响。在结直肠癌细胞中，MTHFD2水平增加引起S期细胞比例增加，细胞增殖加快，反之则细胞增殖减慢[14]。在卵巢癌中，Li等[13]发现抑制MTHFD2表达导致细胞周期蛋白B1/细胞分裂周期基因2复合物活性降低，引起G2/M期阻滞，进而抑制细胞增殖。在非小细胞肺癌中，Yu等[12]通过生物信息学分析并证实了MTHFD2敲降后，细胞周期蛋白A2、微小染色体维持蛋白7和S期激酶相关蛋白2的表达水平下调，进而抑制细胞增殖。在鼻咽癌中，MTHFD2敲降后，明显抑制HK1、HNE1和6-10B细胞的增殖和集落形成能力[20]。但是，MTHFD2对肝癌细胞的增殖和周期分布无显著作用[21]。由此可见，MTHFD2对肿瘤细胞增殖能力的影响并不一致，而因肿瘤类型或细胞类型的不同而作用不同。

2.2 MTHFD2与细胞迁移和侵袭

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程对于肿瘤发生转移是必不可少的[22]。多项研究表明，MTHFD2主要通过调节EMT和/或EMT相关信号通路的变化参与调控肿瘤细胞的迁移和侵袭过程。Liu等[21]的研究显示，肝癌细胞Huh-7和HepG2中MTHFD2的表达被抑制后，上皮标志物E-钙黏蛋白表达水平升高，间叶标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白表达水平降低，EMT过程受阻，导致细胞迁移和侵袭能力减弱。Shi等[23]在肺腺癌细胞H1299和H1975中敲降MTHFD2后，发现EMT的变化与在肝癌中的研究结果类似，即EMT过程被抑制。随后该团队通过基因集富集分析和Western-blot技术验证了MTHFD2可以激活AKT/糖原合成激酶3β/β-连环蛋白信号通路进而促进肺腺癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR8中，Li等[13]利用Western-blot技术发现MTHFD2表达下调引起信号转导及转录活化蛋白3诱导的EMT过程受阻，进而抑制卵巢癌细胞的恶性进展。

血管生成是指新生血管形成的过程，在肿瘤恶性进展中起着重要作用。Hitzel等[24]团队在研究用氧化磷脂处理内皮细胞后的代谢重编程过程中，通过建立贝叶斯(Bayesian)网络模型发现了MTHFD2这一关键驱动因子；后续利用体外小鼠类器官模型，发现用siRNA敲降MTHFD2后，血管形成减少，若同时加入甘氨酸处理，血管形成能力有所恢复，表明依赖于MTHFD2的甘氨酸合成是血管生成所必备的；此外，该团队在斑马鱼胚胎中敲降MTHFD2后，斑马鱼胚胎脉管系统的形态发生异常，进一步确认了MTHFD2对血管生成的重要性。血管生成在一定程度上与肿瘤的进展、侵袭和转移能力密切相关[25]，MTHFD2极有可能通过参与代谢的重编程影响血管的生成，从而加速肿瘤的恶性进展过程。以上研究均提示MTHFD2在肿瘤细胞迁移和侵袭方面具有较一致的促进作用，但是由于肿瘤细胞所处微环境的复杂性，MTHFD2调节细胞迁移和侵袭的机制各不相同，仍需深入研究。

2.3 MTHFD2与细胞死亡

细胞死亡如凋亡、坏死、自噬等是被周密调控的复杂过程[26]。在持续的外界或自身不良因素作用下，细胞死亡的调控被打乱，异常的细胞可能会出现增殖加快，死亡减少等现象，最后导致细胞向恶性转变。在卵巢癌中敲降MTHFD2表达后采用凋亡检测显示凋亡细胞比例明显增加[13]。在肺腺癌中，Shi等[23]在体内外，分别利用流式细胞术及TUNEL实验证明，MTHFD2敲降后，肺腺癌细胞PC-9和H1975凋亡显著增加。同样地，在结直肠癌RKO和SW-480细胞中过表达MTHFD2后，与对照组比较，过表达MTHFD2组中凋亡细胞显著减少[14]；但也有报道[21]表明，MTHFD2对肝癌细胞的凋亡并不产生显著影响，提示MTHFD2对凋亡的影响可能跟肿瘤类型相关。然而MTHFD2对其他细胞死亡形式的作用鲜少报道，有待深入探索挖掘。

2.4 MTHFD2与肿瘤治疗

因MTHFD2是一碳代谢中的主要酶之一，且其生物学功能不断被挖掘，研究者开始致力于探索其在治疗上的作用。在肝癌细胞中，Liu等[21]发现抗肿瘤代谢药物MTX不仅能够降低MTHFD2的表达，同时在MTHFD2敲降的细胞中用MTX处理后，细胞的增殖活性降低更显著。Lin等[2]在肾癌细胞中做了类似的实验，发现在MTHFD2敲降的786-O细胞中，用MTX或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)处理后，细胞增殖活性被显著抑制。这在一定程度上表明，MTHFD2的表达与化疗药物MTX和5-FU的敏感性值得被关注。

DS18561882是一种可口服的MTHFD2特异性抑制剂，Lee等[27]将DS18561882与细胞周期检查点激酶1抑制剂结合起来，在体内外验证了二者协同诱导三阴乳腺癌细胞凋亡的作用。Ju等[28]构建了结直肠癌人源性异种移植小鼠模型，并使用MTHFD2抑制剂LY345899处理，发现肿瘤生长受到抑制、细胞凋亡增加、肠系膜转移结节明显减少。Bonagas等[29]在体内急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)动物模型上，应用强效MTHFD2小分子抑制剂TH9619，并与AML的标准治疗药物阿糖胞苷(cytosine arabinoside，AraC)的效果进行比较，发现TH9619处理的小鼠体质量未发生改变且生存时间更长，而AraC处理的小鼠体质量减轻，提示TH9619在体内的毒性更小。Yang等[30]制备了一种新型的纳米平台，以酮缩硫醇交联的氟化聚乙烯亚胺作为基因载体，形成包含MTHFD2和谷胱甘肽过氧化酶4敲降质粒的活性氧反应纳米颗粒，并利用这两种颗粒的促凋亡和诱导铁死亡的作用共同处理癌细胞，在理论上安全有效且毒性小。这些报道为MTHFD2作为恶性肿瘤治疗靶标，将其抑制剂或敲降质粒用于恶性肿瘤的临床治疗提供了有力证据和思路。

3 小结与展望

MTHFD2作为一碳代谢途径中至关重要的酶，其功能活跃，与核苷酸合成、NADPH产生和氧化还原防御等密切相关。MTHFD2在多种恶性肿瘤中异常表达，且与患者的预后相关，但其分子机制各不相同，甚至有个别报道表明，MTHFD2很有可能不依赖其酶活性参与到肿瘤的恶性进展中。因此，在恶性肿瘤中，MTHFD2很有可能是具有双重功能的蛋白，在特定的肿瘤微环境通过影响着肿瘤的恶性表型，进而影响肿瘤的恶性进展。

另外，影响肿瘤代谢是抗肿瘤药物研发的重要环节，尽管已经有MTHFD2相关抑制剂的报道，但是应用到肿瘤本身的体内外研究仍较少，MTHFD2抑制剂的发现、制备以及在MTHFD2高表达的肿瘤中对其有效性和毒性进行体内外的验证等问题，仍需进一步深入探讨。MTHFD2若真正应用到临床，亟需解决的问题还较多。例如，MTHFD2作为一碳代谢的主要酶类，能否直接作为临床上的靶标；了解MTHFD2酶活性缺如状态下生物学功能改变的具体机制；以及解决MTHFD2抑制剂的临床应用等难题。总之，以MTHFD2为靶标以及以干扰肿瘤异常代谢为目的的治疗方法，势必成为未来恶性肿瘤预防诊断以及治疗的新策略，真正的完善还需要更多的研究。