宏基因组下一代测序技术在肺部感染中的临床应用

许慧芬 韩开宇

由细菌、病毒或真菌等病原体引起的肺部感染在全球范围内的发病率和死亡率呈上升趋势，是导致生命死亡的主要原因之一[1-2]。作为一种呼吸道感染性疾病，肺部感染可引起多种并发症[3]，特别是在基础疾病多、免疫功能差的患者中[4]，将极大的影响患者的预后[5]。由于患病环境、患病人群、疾病严重程度、检测技术的不同，致病微生物也不尽相同[6]。同时多种多重耐药菌以及新型病原体的大量出现，也给临床医生在抗菌治疗时带来了挑战[7]。因此尽早识别微生物病原体、确保精准抗生素治疗是至关重要的[8]。然而目前明确病原体的传统检测方法，耗费时间长且检出率低下[9]，在我国有近半数肺部感染患者的病因诊断尚不明确[6]，仅能在 30%～40% 的 CAP 患者中识别病原体[10-11]。新型的病原体诊断工具mNGS也因此备受青睐。mNGS 通过对提取的 DNA或RNA 进行直接测序，可以对样本中存在的几乎所有病原体进行无偏移检测[12-13]。理论上mNGS不仅可以检测临床样本中的任何微生物[14]，而且可以区分病原微生物和背景共生菌[15]。 mNGS以其快速且精准的检测优势，可帮助临床迅速和准确的控制感染[16-17]。

mNGS的原理和应用

作为一种强大的病原体检测工具，mNGS能在短时间内(约16～24 h)一次性完成对上万种病原体的检测，在辅助判断病原的同时，可获取样本中菌群的分布与占比信息。其检测原理是将样本中提取的核酸进行片段化和测序接头连接后进行测序，获得样本中的核酸序列信息，再通过与微生物专用数据库进行比对分析，获得宏基因组中包含的微生物的检出列表。其测序过程主要包括两个部分：湿实验和干实验。湿实验操作包括样品预处理、核酸提取、文库构建和测序。干实验生物信息学分析包括数据质量控制、人类序列去除、微生物物种序列的比对以及耐药性或毒力基因分析[18-19]。

mNGS现已应用于超过9个人体功能系统感染性疾病的病原体检测，特别是在中枢神经系统、呼吸系统、血液系统和局灶组织感染中[18, 20-25]。mNGS可以从各个系统不同临床样本中直接鉴定病原体，其准确性和灵敏度均优于传统培养[26]，且基本不受先前抗生素暴露的影响[21]，特别是对于新型的、罕见的、难以培养的病原体(如分枝杆菌、厌氧菌、奴卡菌等)[27]。此外，在病情危重、免疫力低下和混合病原体感染的患者中[28-31]，mNGS也发挥着极大的优势。当前mNGS 还可以为进化追踪、预测抗生素耐药性和证实毒力因子的存在提供基因信息，并可根据序列数推断相关病原体的丰度[32-33]。总之，mNGS在感染性疾病的临床应用中显示出巨大潜力。

mNGS在肺部感染病原体检出中的应用

一、细菌检出

有研究发现在140例疑似肺部感染的患者中，mNGS诊断的敏感性远高于常规培养，而特异性却相反，mNGS检出最多的革兰氏阳性细菌是微小微单胞菌、肺炎链球菌、粪肠球菌。检出最多的革兰氏阴性菌是流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌[34]；在329名重症社区获得性肺炎患者中，mNGS的细菌病原体检出阳性率要高于常规检测，mNGS检出最多的细菌是肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌[35]；在72例呼吸机相关肺炎患者中，mNGS检测阳性样本的百分比也显著高于常规检测，特别是鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌[36]。同样有研究显示mNGS在检测肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和普雷沃氏菌方面的阳性率显著升高[28]。但另有研究发现，与mNGS相比，常规检测能够识别出大多数与细菌相关的肺炎[37]。这提示我们临床医生，mNGS的细菌病原体检出阳性率和敏感性要优于常规检测，且mNGS不容易受到先前抗生素使用的影响[21, 38]。但是在肺部感染常见病原体的检出中，mNGS是常规检测的补充手段，并不能完全取代传统培养。

二、真菌检出

多项研究表明，mNGS在真菌病原体检出方面发挥着巨大的优势。在疑似肺部真菌感染的106例患者中，mNGS在诊断肺部真菌感染方面的敏感性显著高于常规检测[39]。另一项研究中，常规培养仅在 1/21 样本中鉴定出真菌性肺炎，而mNGS 却在 19/21 样本中鉴定出真菌性肺炎[40]。同样在13例肺孢子虫肺炎中，通过 mNGS 在所有患者中均检测到肺孢子菌，而常规检测仅在 5/13 样本中检测到肺孢子菌[41]。但是也有研究提出不同观点，即mNGS在真菌检出方面与常规检测相比，无统计学差异[21,28]。更有研究显示对于某些真菌病原体，常规检测阳性率要高于mNGS，如白色念珠菌和热带念珠菌[36]。与之相似，有研究提出mNGS在隐球菌检测方面敏感性低于血清抗原检测[21]；造成这些差异结果的原因，可能与不同研究中患者病情严重程度、患病环境、采样标本不同相关。总之，对于常规实验室检测难以发现和明确的真菌感染，mNGS技术是临床医生的推荐选择。

三、病毒检出

目前mNGS是发现病毒的首选方法，特别是对于新出现的引起肺炎的病毒(如 SARS、MERS和H7N9)，mNGS有助于追踪和控制爆发[42]。此外mNGS还具有识别常规检测方法难以检测到的额外病毒的潜力[43]。在一项171 名肺部感染患者的研究中，mNGS检出病毒60例，最常检测到的病毒是人疱疹病毒5型、人疱疹病毒 4 型、人细小病毒 B19等，而常规检测方法几乎对所有病毒都呈阴性[29]。另一项对72名肺部感染患者的研究中，mNGS检出病毒30例，同样常规检测方法、病毒检测均为阴性[36]。但是，也有研究表明对于常见呼吸道病毒的检出，mNGS的敏感性低于PCR，如甲型流感病毒和鼻病毒[43]。造成这一结果的原因可能是在测序过程中，mNGS仅进行了DNA测序，故只检测到DNA病毒，而PCR法可以检测RNA病毒，如甲型流感病毒和乙型流感病毒[44]，故在一定程度上影响了病毒的检出。大量研究已证实，mNGS的诊断效能，优于传统检测方法。如今，mNGS通过测序获得的病原体信息不仅可以指导临床抗病毒药物的使用(包括药物的启动、升级、降级或停药)，而且可以通过使用mNGS技术评估严重下呼吸道病毒感染患者的预后[45]。

四、罕见及新型病原体的检出

mNGS因其无偏移的检测优势，在不明原因肺炎的病因诊断中起着至关重要的作用，尤其是对于新型的、罕见的以及传统检测方法难以培养的病原体[21, 46-47]。在一项纳入159名肺部感染患者的大规模多中心前瞻性研究中，mNGS在识别引起肺部感染，难以培养的、非典型微生物方面(如军团菌、肺炎支原体、鹦鹉热衣原体、非结核分枝杆菌)发挥了重要价值[48]。众所周知，由于苛刻的生长要求、有限的检测方法和非特异性临床表现，诊断军团菌肺炎具有挑战性，而mNGS检测提高了军团菌的检出率，极大地改善了因军团菌所致重症肺炎患者的预后[49]。mNGS技术不仅打开了认识病原体的大门，而且为临床医生了解微生物的特点和指导用药，也提供了巨大的帮助。例如，通过mNGS技术可以检测到鹦鹉热衣原体、奴卡菌等罕见病原体，通过总结患者的临床特征、检验和检查结果、影像学特征、治疗和预后等，使临床医生更好地了解疾病，从而日后可早期识别疾病，减少不必要的抗生素使用，缩短病程[27, 50]。

mNGS在免疫功能低下患者群体中的应用

有研究发现在免疫功能受损的社区获得性肺炎患者BALF样本中，常规检测方法在 6/13样品中鉴定出病原体，而mNGS 在12/13样品中鉴定出病原体。且研究发现肺孢子菌和巨细胞病毒是这13名患者中最常见的病原体[51]；当mNGS应用于造血干细胞移植合并急性呼吸道疾病患者的BALF时，研究发现对于某些呼吸道微生物(如呼吸道合胞病毒、嗜麦芽窄食单胞菌、人疱疹病毒6型、巨细胞病毒等)，mNGS的诊断敏感性可达100%[52]；不仅如此，通过mNGS技术，临床医生对免疫功能受损患者的致病微生物谱有了新的认识。例如，研究发现，在免疫功能受损患者群体中，肺孢子菌和巨细胞病毒的感染率更高，而肺炎支原体感染率显著降低，同时存在着更多潜在致病病原体感染，更多混合病原体感染[53]。与前述研究相一致，对免疫功能低下和免疫功能正常的重症社区获得性肺炎患者进行BALF的mNGS检测，研究发现在免疫功能低下的SCAP患者中，检出了更多的肺孢子菌、白色念珠菌和人类疱疹病毒5型，同时发现了更多的混合病原体感染[54]。此外，利用mNGS还可以揭示中国大陆肺部感染ICU入院患者的抗生素耐药菌谱[55]。一直以来，免疫功能受损肺炎患者的死亡率高于免疫功能正常肺炎患者[12]。上述研究均表明，mNGS在免疫功能低下患者的病原体检出中具有优势，mNGS可以帮助临床医生认识病原谱，指导疾病的治疗，改善患者预后，降低死亡率。

肺部感染患者不同样本的比较

在现有研究中，为明确肺部感染病原体，mNGS可采用的样本有BALF、肺组织、胸水、痰液、咽拭子、外周血等，不同样本类型病原体检出的敏感性和特异性略有差异。针对BALF样本，Chen等人通过对235名疑似肺部感染患者的BALF进行mNGS检测，研究发现mNGS的敏感性和特异性分别为88.89%和14.86%。排除罕见病原体后，其敏感性降低至73.33%，特异性提高至41.71%[56]；针对肺组织样本，Li等人在20例肺部感染患者的肺组织中进行mNGS检测，研究发现mNGS的敏感性和特异性分别为100.0%和 76.5%[16, 28]；同样Guo等人也进行了肺组织样本的mNGS检测，研究发现，与培养相比，mNGS的敏感性为83.3%，特异性为79.1%。值得一提的是，该研究首次建立了在肺组织样本中基于Illumina平台同时检测病原体和癌症的管道[57]；将BALF与肺组织样本对比，研究发现在肺组织中mNGS的特异性高于BALF，但BALF的敏感性更高[58]；将BALF与痰液标本对比，研究发现两样本对于病原体检出的敏感性和特异性无显著差异，且在检测结果中具有显著一致性[59]；将BALF与血液标本对比，研究发现对于细菌和真菌检测，BALF比血液更敏感，但两者的特异性却没有显著差异[60]。也有研究表明，mNGS在血液中检测到的病毒总体上比 BALF多，但是在某些患者的BALF中，mNGS检测到某种特定病毒的序列却比血液多，如EB病毒、巨细胞病毒等[61-62]；将经皮肺活检(TBLB)、支气管刷检(BB)、BALF三种样本对比，研究发现不同样本类型之间敏感性差异无统计学意义，然而mNGS在TBLB 标本中具有最高的特异性，其次是 BB，最后是 BALF，综合敏感性和特异性，BB标本优于TBLB和BALF标本[40]；将BALF、痰、血浆、鼻咽拭子等多样本进行mNGS检测比较，研究发现BALF和痰液是检测病原体最有效的样本类型，阳性率为75%，而外周血样本只有35%的阳性结果[53]。

综上，结合各项研究结果以及我们的临床经验，mNGS在呼吸道不同样本类型之间敏感性几乎没有差异。在实际临床工作中，BALF在重症肺炎患者床头支气管镜下容易获取，且代表了肺泡水平的成分，更适用于干咳或无咳嗽咳痰的肺部感染患者[63]。但是对于患者来讲，他们很难接受侵入性操作，甚至会因此产生紧张焦虑的心情。同样肺组织标本的获取也需要经过有创操作，其更适用于外周肺部感染难以明确病原体的患者。相比之下痰液和咽拭子临床容易获取，而且病人容易接受，但是痰和咽拭子标本极易受到污染，对于鉴定病原体是致病菌还是污染菌有一定难度。而对于血液标本，我们需要认识到血液中的病原体DNA可能反映了肺部感染，也可能是来自身体其他部位的感染[64]。这均提示我们临床医生，在面对肺部感染的患者时，要根据患者的临床特点，感染病灶位置、以及病情严重程度等综合考虑，个体化选取最佳的采样标本。

mNGS的局限性

目前，mNGS在肺部感染临床实际应用中，仍存在一些问题：首先，肺部本身不是无菌环境，在样本采集过程中也不能保证绝对无菌，而mNGS 不仅可以检测到感染病原体，还反映了正常的微生物菌、定植菌和样本污染菌，这给mNGS 的病原体解释带来了挑战。其次RNA测序难以进行，RNA检测可以同时识别死亡和存活的病原体，并可以区分过去和当前的感染，然而人源RNA的丰度和复杂度较DNA高，并且容易降解，这对样品的运输和储存提出了更高的要求，也因此限制了RNA的检出[65]。最后，mNGS测序成本较高，且尚未纳入医保范围之内，患者个人承担费用较高，在一定程度上限制了mNGS的推广使用。

结 语

综上所述，mNGS在肺部感染病原体检测中发挥着巨大的优势，其对细菌、真菌、病毒等病原体的检出具有诊断价值，甚至可以检出新型的、罕见的、难以培养的病原体，尤其适用于免疫功能低下的患者群体。针对肺部感染患者应采集的不同临床样本，临床医生需结合患者的实际情况进行选择。目前mNGS技术尚不能完全取代传统培养方法，但可作为强大的补充手段发挥优势。未来随着技术的不断完善，mNGS有望在临床工作中发挥更大的价值。