高危型HPV阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表达的相关性及临床意义

2022-12-23赵丽娜闫丽隽范丽君

分子诊断与治疗杂志 2022年11期

赵丽娜闫丽隽范丽君

人乳头瘤病毒（human papil loma virus，HPV）感染、特别是HPV16 及HPV18 等高危型HPV 感染是宫颈癌发病的独立危险因素［1］。微小RNA（microRNA，miR）是一类具有广泛生物学作用的非编码小分子RNA，病毒感染可能通过改变miR 表达的方式进一步引起下游癌基因表达的变化，进而导致恶性肿瘤的发生发展［2］。miR-let-7d-5p是一种具有抑癌作用的miR，在多种恶性肿瘤的发生发展过程中通过靶向抑制高迁移率族蛋白A1（High mobility group protein A1，HMGA1）表达的方式抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭［3］。张鹏飞在HPV16 阳性的宫颈癌细胞中观察了miR-let-7d-5p的生物学作用，结果证实HPV16 阳性的宫颈癌细胞中miR-let-7d-5p的表达水平显著降低，过表达miR-let-7d-5p显著促进癌细胞的凋亡并抑制癌细胞的迁移、侵袭［4］，这一结果表明miR-let-7d-5p的低表达可能参与高危型HPV 感染导致宫颈癌发生发展的过程。本研究将分析高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表达的相关性及临床意义，旨在为深入认识高危型HPV 感染导致宫颈癌发生发展的生物学机制提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2020 年4 月至2021 年4 月期间在山西省肿瘤医院接受根治性手术的114 例宫颈癌患者作为研究对象，年龄平均（52.83±9.21）岁，FIGO 分期Ⅰ期48 例、ⅡA 期66 例，鳞癌79 例、腺癌18 例、腺鳞癌17 例。术后留取宫颈癌组织和癌旁组织（距离病灶边缘≥5 cm），用于高危型HPV 检测及基因表达检测。纳入标准：①参照指南［5］，经术后病理诊断为宫颈癌；②参照指南［5］，FIGO 分期Ⅰ～ⅡA期；③按要求留取组织样本；④临床病理资料完整。排除标准：①术前接受过放化疗；②合并急慢性感染、免疫系统疾病；③既往有其他恶性肿瘤病史。所有患者及家属均签署知情同意书。本研究取得医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 高危型HPV 的检测

取宫颈癌组织，采用基因组DNA 提取试剂盒分离提取基因组DNA，设计HPV16基因及HPV18基因的特异性引物，分别进行PCR 反应，反应程序：95℃5 min 后95℃1 min、55℃30 s、72℃30 s，重复40 次后得到PCR 产物。在2%琼脂糖凝胶中对PCR 产物进行电泳，在紫外凝胶成像仪（WD-9413A，济南童鑫生物科技公司）显影得到图像，HPV16基因的PCR 产物长度为152 bp、HPV18基因的PCR 产物长度为471 bp。

1.2.2miR-let-7d-5p、HMGA1表达的检测

取宫颈癌组织，采用总RNA 提取试剂盒提取RNA，采用反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，采用荧光定量PCR 试剂盒对cDNA 中的目的基因miR-let-7d-5p、HMGA1及内参基因U6进行扩增，反应体系为：cDNA 1 μL、试剂盒内反应混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去离子水7.8 μL；反应程序为：95℃预变性3 min 后95℃15 s、特异性退火温度（miR-let-7d-5p60℃、HMGA162.0℃、β-ɑctin58.0℃）25 s、72℃30 s，重复40 次后得到PCR 反应的循环曲线及循环阈值（Cycle threshold，Ct），以U6为内参、按照公式2-ΔΔCt计算HMGA1的mRNA 表达水平。

1.2.3 预后的随访

采用电话回访、门诊复诊等方式进行随访，随访截止至2022 年3 月31 日，随访内容包括患者发生复发、转移及死亡的情况，分别计算累积无进展生存率和累积总生存率。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计学处理，计量资料以（±s）表示、两组间比较采用独立样本t检验、多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson 检验；预后采用K-M 曲线表示，组间比较采用log rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织高危型HPV 的PCR 检测结果

宫颈癌组织中HPV16及HPV18基因PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1，HPV16基因的PCR 产物长度为152 bp、HPV18基因的PCR 产物长度为471 bp。宫颈癌组织高危型HPV 阳性99 例、阴性15 例，高危型HPV 感染率86.74%。

图1 宫颈癌组织中HPV16 及HPV18 基因PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图Figure 1 Agarose gel electrophoresis of HPV16 and HPV18 gene PCR products in cervical cancer

2.2 宫颈癌组织与癌旁组织中miR-let-7d-5p、HMGA1 表达水平的比较

宫颈癌组织中miR-let-7d-5p的相对表达水平低于癌旁组织，HMGA1的mRNA 相对表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 宫颈癌组织与癌旁组织中miR-let-7d-5p、HMGA1表达水平的比较（±s）Table 1 Comparison of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels between cervical cancer and adjacent tissues（±s）

组织宫颈癌组织癌旁组织t 值P 值n 114 114 miR-let-7d-p 0.72±0.19 1.00±0.17 11.627 0.000 HMGA1 1.35±0.31 1.00±0.19 10.278 0.000

2.3 高危型HPV 阳性与阴性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表达水平的比较

高危型HPV阳性的宫颈癌组织中miR-let-7d-5p的相对表达水平低于高危型HPV 阴性的宫颈癌组织，HMGA1的mRNA 相对表达水平高于高危型HPV 阴性的宫颈癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 高危型HPV 阳性与阴性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表达水平的比较（±s）Table 2 Comparison of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels in high-risk HPV positive and negative cervical cancer（±s）

高危型HPV阳性阴性t 值P 值n 99 15 miR-let-7d-5p 0.71±0.19 0.84±0.14 2.543 0.012 HMGA1 1.39±0.30 1.13±0.26 3.189 0.002

2.4 高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表达水平的相关性

高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p的表达水平与HMGA1的mRNA 相对表达水平呈负相关，相关系数为-0.428（P＜0.05）。见图2。

图2 高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表达水平相关性的散点图Figure 2 Scatter plot of the correlation between the expression levels of miR-let-7d-5p and HMGA1 in high-risk HPV positive cervical cancer

2.5 高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表达水平与临床病理特征的关系

不同年龄、病理类型的高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；FIGO 分期ⅡA 期高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p的表达水平低于FIGO 分期Ⅰ期高危型HPV 阳性宫颈癌，HMGA1的mRNA 相对表达水平高于FIGO 分期Ⅰ期高危型HPV 阳性宫颈癌，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表达水平与临床病理特征的关系（±s）Table 3 Relationship between the expression levels of miRlet-7d-5p，HMGA1 and clinicopathological features in highrisk HPV positive cervical cancer（±s）

特征年龄n t/F 值1.052 P 值0.295 t/F 值0.469 P 值0.469病理类型1.2820.138 0.1090.109 FIGO 分期分类＜55 岁≥55 岁鳞癌腺癌腺鳞癌Ⅰ期ⅡA 期63 51 79 18 17 48 66 miR-let-7d-5p 0.69±0.22 0.74±0.25 0.73±0.20 0.67±0.24 0.68±0.25 0.77±0.22 0.67±0.18 2.4870.015 HMGA1 1.33±0.32 1.38±0.36 1.36±0.35 1.32±0.37 1.31±0.37 1.26±0.34 1.42±0.31 0.0160.016

2.6 高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表达水平与预后的关系

高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p表达≥中位数的患者累积无进展生存率高于miR-let-7d-5p表达＜中位数的患者，高危型HPV 阳性宫颈癌中HMGA1表达≥中位数的患者累积无进展生存率低于HMGA1表达＜中位数的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；高危型HPV 阳性宫颈癌中不同miR-let-7d-5p、HMGA1表达水平的患者累积总生存率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、4。

图3 高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表达水平与无进展生存的K-M 曲线Figure 3 K-M curve of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels and progression free survival in high-risk HPV positive cervical cancer

图4 高危型HPV 阳性宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表达水平与总生存的K-M 曲线Figure 4 K-M curve of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels and overall survival in high-risk HPV positive cervical cancer

3 讨论

高危型HPV 感染是导致宫颈癌发病的明确危险因素，感染宫颈上皮细胞的HPV 能够将病毒基因组整合进入宿主细胞并引起细胞内多种癌基因表达发生改变，在此基础上会发生上皮内瘤变、原位癌及浸润癌等阶梯式改变。

近些年关于高危型HPV 感染的相关基础研究证实，高危型HPV 阳性的宫颈癌细胞株中存在多种miRs、长链非编码RNA、环状RNA 等非编码RNA 表达的变化，可能原因是HPV 的E6、E7 基因整合进入宿主基因的不同位点、引起邻近非编码RNA 转录的改变，进而造成不同非编码RNA 表达的上调或下调［6-7］。miR-let-7d-5p是目前已知具有抑癌作用的miR，在食管癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中均表现出表达降低的趋势［8-10］。本研究结果提示miR-let-7d-5p低表达可能削弱其抑癌作用、进而导致宫颈癌的发生。

目前关于HPV 感染与miR-let-7d-5p表达之间相互关系的研究主要停留在细胞实验阶段，国内张鹏飞和国外Honegger 等［11］的细胞实验分别证实HPV16 阳性和HPV18 阳性的的宫颈癌细胞中miR-let-7d-5p的表达降低，提示高危型HPV 感染可能是miR-let-7d-5p表达的上游调控因素。本研究结果提示高危型HPV 感染在宫颈癌中可能抑制miR-let-7d-5p的表达，进而削弱miR-let-7d-5p的抑癌作用并促进宫颈癌的发生发展。

根据目前miR-let-7d-5p抑癌的相关基础研究结果，HMGA1是miR-let-7d-5p的靶基因之一。HMGA1属于高迁移率族蛋白，在宫颈癌中表达增加且对宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭均具有促进作用［12-13］。本研究结果提示高危型HPV 感染可能通过抑制miR-let-7d-5p表达的方式促进HMGA1的表达、增强HMGA1介导的促癌作用。宫颈癌细胞不断的增殖、迁移、侵袭会造成肿瘤病理进展、FIGO 分期增加，本研究的分析显示：随着HPV 阳性宫颈癌的FIGO 分期从Ⅰ期进展至ⅡA 期，局部组织中miR-let-7d-5p的表达降低、HMGA1的表达增加，表明miR-let-7d-5p及HMGA1表达的变化参与了高危型HPV 阳性宫颈癌的病理进展。

最后，本研究还对入组的宫颈癌患者进行了预后随访。高危型HPV 感染不仅是宫颈癌发病的独立危险因素，也是预后不良的影响因素之一［14-15］。本研究对总生存和无进展生存进行了随访，结果显示高危型HPV 阳性的宫颈癌中miR-let-7d-5p、HMGA1的表达与无进展生存有关，miR-let-7d-5p表达降低、HMGA1表达增加会造成累积无进展生存率降低，但受限于随访时间较短、未观察到累积总生存率有统计学差异的结果。

综上所述，高危型HPV 感染的宫颈癌中miR-let-7d-5p表达降低、HMGA1表达增加，上述表达变化与FIGO 分期进展、无进展生存率降低有关。