宫腔粘连组织中miR-22、TGFβR1 表达与三维能量超声参数的相关性及临床意义

张友 王琮 杨燕

宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）是子宫内膜基底层破坏后出现的子宫壁之间的粘连，多见于人工流产、刮宫等宫腔操作后，会导致月经异常以及不孕。IUA 的常用治疗手段是宫腔镜下IUA 松解术或切除术，虽然手术操作的技术不断进步，但手术操作仍不可避免会造成子宫内膜损伤并导致术后再次发生IUA［1-2］。细胞外基质沉积是IUA 发生发展的重要生物学特征，转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是调控细胞外基质代谢的关键细胞因子，其与TGF-β 受体1（TGF-β receptor 1，TGFβR1）结合后能够促进细胞外基质的水解和异常沉积，进而促进组织纤维化及粘连［3］。国内一项研究证实，微小RNA（microRNA，miR）-22 是TGFβR1的上游调控分子，过表达miR-22能够抑制TGFβR1并改善IUA大鼠的组织粘连［4］。为了进一步认识miR-22靶向调控TGFβR1在IUA 发病中的作用，本研究将以IUA 患者为对象，通过三维能量超声评价组织粘连程度，分析IUA 组织中miR-22、TGFβR1表达与三维能量超声参数的相关性及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2018 年1 月至2020 年12 月于安徽理工大学第一附属医院接受IUA 分离术的48 例IUA患者作为IUA 组，纳入标准：①符合指南中IUA 的诊断［5］；②存在月经异常和周期性腹痛；③接受宫腔镜手术；④有妊娠需求。排除标准：①合并生殖系统先天畸形；②合并多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等妇科疾病；③合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病等。选择54 例接受宫腔镜检查的输卵管性不孕患者作为对照组。IUA 组患者年龄21～44 岁、平均（31.25±5.49）岁，体质量指数（23.12±6.23）kg/m2；对照组患者年龄21～42 岁、平均（28.71±5.33）岁，体质量指数（22.89±6.82）kg/m2。两组间一般资料的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究取得医院伦理委员会批准，获得入组患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1miR-22、TGFβR1表达水平的检测

取IUA 组和对照组的子宫内膜组织，采用总RNA 提取试剂盒提取组织中的RNA，采用反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，采用荧光定量检测试剂盒对cDNA 中的miR-22、TGFβR1进行荧光定量PCR 检测。检测的反应体系如下：cDNA 1 μL、试剂盒内反应混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去离子水7.8 μL；反应程序为：95℃预变性3 min 后95℃15 s、特异性退火温度25 s、72℃30 s，重复40次。所用基因的引物序列及特异性退火温度见表1。完成反应后得到循环曲线及循环阈值（Cycle threshold，Ct），以β-ɑctin为内参、按照公式2-ΔΔCt计算miR-22、TGFβR1的相对表达水平。

表1 miR-22、TGFβR1、β-ɑctin 的引物序列及退火温度Table 1 Primer sequence and annealing temperature of miR-22，TGFβR1，β-ɑctin

1.2.2 子宫内膜三维能量超声检查

采用三维多普勒超声仪对两组患者进行三维能量超声检查，探头频率3～9 MHz，首先进行常规超声探查，显示子宫最大纵切面后固定该平面，启动能量多普勒模式，取样框比子宫略大、将子宫完全包绕，启动三维功能键并勾勒子宫内膜轮廓，检测体积（Volume，V）、血管指数（vascular index，VI）、血流指数（flow index，FI）、血管血流指数（vascular flow index，VFI）。

1.2.3 IUA 严重程度及预后的评估

参照指南［5］中Nasr 宫腔粘连分级评估IUA 严重程度，从峡部粘连、膜状粘连、致密粘连、输卵管开口、管状宫腔、月经类型、孕产史进行评分，计算总得分，0～4 分为轻度、5～10 分为中度、11～22 分为重度。根据妊娠情况评价IUA 患者的预后，共随访2 年。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，采用独立样本t检验进行两组间比较，采用Pearson 检验进行相关性分析，采用K-M 曲线及log rank 检验分析累积妊娠率的差异。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IUA 组与对照组miR-22、TGFβR1 表达水平的比较

IUA 组局部组织中miR-22的相对表达水平低于对照组，TGFβR1的相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 IUA组与对照组miR-22、TGFβR1表达水平的比较（±s）Table 2 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels between IUA group and control group（±s）

表2 IUA组与对照组miR-22、TGFβR1表达水平的比较（±s）Table 2 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels between IUA group and control group（±s）

组别IUA 组对照组t 值P 值n 48 54 miR-22 0.66±0.17 1.00±0.22 5.489 0.000 TGFβR1 1.29±0.25 1.00±0.28 8.653 0.000

2.2 IUA 组miR-22、TGFβR1 表达水平的相关性

IUA 组局部组织中miR-22的相对表达水平与TGFβR1的相对表达水平呈负相关，相关系数为-0.4146。见图1。

图1 IUA 组miR-22、TGFβR1 表达水平的相关性Figure 1 Correlation of miR-22 and TGFβR1 expression level in IUA group

2.3 IUA 组中不同严重程度患者miR-22、TGFβR1表达水平的比较

IUA 组中中重度患者局部组织中miR-22的相对表达水平低于轻度患者，TGFβR1的相对表达水平高于轻度患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 IUA 组中不同严重程度患者miR-22、TGFβR1 表达水平的比较（±s）Table 3 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels among patients with different severity（±s）

表3 IUA 组中不同严重程度患者miR-22、TGFβR1 表达水平的比较（±s）Table 3 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels among patients with different severity（±s）

严重程度轻度中重度t 值P 值n 26 22 miR-22 0.75±0.22 0.55±0.19 3.171 0.003 TGFβR1 1.10±0.24 1.52±0.32 4.640 0.000

2.4 IUA 组与对照组三维能量超声参数的比较

IUA 组患者子宫内膜的三维能量超声参数V、VI、FI、VFI 均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表4。

图2 宫腔粘连的超声图像Figure 2 ultrasonic image of intrauterine adhesion

表4 IUA 组与对照组三维能量超声参数的比较（±s）Table 4 Comparison of three-dimensional energy ultrasonic parameters between IUA group and control group（±s）

表4 IUA 组与对照组三维能量超声参数的比较（±s）Table 4 Comparison of three-dimensional energy ultrasonic parameters between IUA group and control group（±s）

组别IUA 组对照组t 值P 值n 48 54 V（cm3）3.41±0.62 4.49±0.77 7.739 0.000 VI（%）3.74±0.89 4.71±0.94 5.333 0.000 FI 23.09±4.51 26.65±6.44 3.195 0.000 VFI 1.16±0.25 1.49±0.31 5.870 0.000

2.5 IUA 组miR-22、TGFβR1 表达水平与三维能量超声参数的相关性

IUA 组患者局部组织中miR-22的相对表达水平与V、VI、FI、VFI 呈正相关，TGFβR1的相对表达水平与V、VI、FI、VFI 呈负相关。见表5。

表5 IUA 组miR-22、TGFβR1 表达水平与三维能量超声参数的相关性Table 5 Correlation between miR-22，TGFvR1 expression level and three-dimensional energy ultrasonic parameters in IUA group

2.6 IUA 组miR-22、TGFβR1 表达水平与预后的关系

IUA 组中不同miR-22、TGFβR1表达水平的患者累积妊娠率的K-M 曲线见图3。经log-rank 检验：IUA 组中miR-22表达≥中位数患者的2 年累积妊娠率高于miR-22表达＜中位数患者，TGFβR1表达≥中位数患者的2 年累积妊娠率低于TGFβR1表达＜中位数患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 K-M 曲线Figure 3 K-M curve

3 讨论

IUA 分离术及切除术是治疗IUA 的常用手段，能够有效分离或清除粘连的宫腔组织，但手术操作也不可避免会造成子宫内膜损害，术后IUA复发的风险较高［6-7］。

成纤维细胞过度增殖、纤维结缔组织异常增生是与IUA 发生密切相关的生物学环节，参与该环节的关键调控分子是TGF-β。TGFβR1是介导TGF-β 生物学效应的膜受体，能够招募下游Smad3 并促进胶原蛋白、层黏连蛋白合成，进而导致组织纤维化的发生［8-10］。一项动物实验通过刮宫术建立了IUA 大鼠模型，IUA 大鼠内膜组织中TGFβR1的表达水平明显增加［4］，提示TGFβR1的高表达与IUA 的发生有关。本研究对IUA 患者进行了检测，与正常子宫内膜组织比较，IUA 子宫内膜组织中TGFβR1的表达水平增加，与上述研究结果一致。进一步通过Nasr 宫腔粘连分级评估IUA 严重程度并分析可知：中重度IUA 患者子宫内膜组织中TGFβR1的表达水平高于轻度IUA 患者，结果表明TGFβR1表达增加与IUA 的发生及粘连程度的加重有关。

TGFβR1表达的上游调控机制复杂，其中miRs能够在转录后水平调控基因表达［11］，多项研究证实TGFβR1是miR-22的下游靶基因之一［12-13］。本研究对IUA 患者进行了检测，与正常子宫内膜组织比较，IUA 子宫内膜组织中miR-22的表达水平降低，与IUA 大鼠中miR-22减轻粘连的生物学作用吻合；同时，miR-22的表达与TGFβR1呈负相关，中重度IUA患者子宫内膜组织中miR-22的表达水平低于轻度IUA 患者。以上结果表明miR-22表达降低与IUA 的发生及粘连程度的加重有关，并且miR-22可能通过靶向调控TGFβR1的参与IUA 的发病。

超声检查是临床诊断IUA 并评估病情的常用手段，三维能量超声是新的超声检查技术，相关的超声特征包括宫腔缩小、子宫内膜容积减小以及粘连组织中血流灌注不足［14］。随着IUA 病情加重，上述超声变化更加显著。本研究对IUA 患者进行了三维能量超声检查，结果显示：与对照组比较，IUA 患者子宫内膜的V、VI、FI、VFI 均降低，符合IUA 发病过程中子宫内膜容积减小以及血流灌注不足的特征［14］。进一步在IUA 患者中进行相关性分析可知：miR-22的表达水平与超声参数V、VI、FI、VFI 呈负相关，TGFβR1的表达水平与超声参数V、VI、FI、VFI 呈正相关，表明IUA 发病过程中miR-22及TGFβR1表达的变化会加重子宫内膜容积减小以及血流灌注不足。

miR-22及其靶向调控的TGFβR1参与成纤维细胞增殖及组织纤维化的调控，两者异常表达可能在术后促进子宫内膜纤维化的发生、严重者出现IUA 复发，进而影响妊娠。本研究对IUA 患者的妊娠情况进行了随访，分析其与miR-22、TGFβR1表达的关系，结果显示，miR-22表达降低、TGFβR1表达增加会导致累积妊娠率显著降低。

综上所述，IUA 组织中miR-22低表达、TGFβR1高表达存在相关性，同时两者表达的变化与粘连加重、子宫内膜体积缩小及血流灌注减少、妊娠预后不良有关。