钠-牛磺胆酸共转运多肽缺陷患儿的肝功能及基因特点

孙雁楠， 朱莉

(1.贵州医科大学 临床医学院， 贵州 贵阳 550000； 2.贵阳市妇幼保健院 儿童消化科， 贵州 贵阳 550000)

钠-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)缺陷病是近几年新发现的一种遗传性胆汁酸代谢疾病，是溶质转运蛋白家族10成员(solute carrier family 10 member 1，SLC10A1)双等位基因突变导致NTCP功能障碍[1]。研究显示NTCP缺陷与新生儿高胆红素血症及婴儿早期胆汁淤积症有关[2-4]。NTCP位于肝细胞基底外侧膜上，可将血浆结合型胆汁酸盐转运至肝脏，当NTCP功能异常时肝脏摄取胆汁酸障碍，血液中胆汁酸堆积，引起高胆汁酸血症为主要表现的血清学指标异常，已发现多个突变位点可促成该病[5-6]。NTCP缺陷病在儿童和成人中均可发病，共同特征均为血浆中持续升高的胆汁酸[2-3，7]，该病于2015年首次报道[7]，国内外报道案例散发[1-4，6-13]，对本病的遗传学特征、临床表现、治疗及远期预后尚无统一定论,需要更多研究和报告进一步充实，因此本研究对经基因检测确诊的11例NTCP缺陷患儿肝功能及基因检测结果进行分析，报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019—2021年经高通量基因测序确诊的NTCP缺陷病患儿作为研究对象，要求年龄≤14岁，胆汁酸升高为主，伴有或不伴有其他肝功能指标异常，遗传代谢性基因检测完善及院外未进行治疗。排除标准：(1)病例资料不完善；(2)解剖结果为异常、感染、药物、静脉营养等所致肝功能异常。共纳入NTCP缺陷病患儿11例，男性6例(54.5%)、女性5例(45.5%)，同时选取患儿父亲11人、母亲11人作为参照，行高通量基因测序。本研究获得医院伦理委员会批准(2022-39)及患儿监护人签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1一般临床资料 收集NTCP缺陷病患儿的年龄、性别、主诉、出生史、胎产次、喂养史、家族史及新生儿期黄疸情况等一般临床资料。

1.2.2肝功能 抽取患儿入院治疗前清晨空腹静脉血5 mL，采用西门子全自动化分析仪[西门子医学诊断产品(上海)有限公司]及相应试剂盒检测血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT；参考值0～40 U/L)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST；参考值0～40 U/L)、总胆红素(total bile acid，TBIL；参考值0～17 μmol/L)、直接胆红素(direct bilirubin，DBIL；参考值0～5.1 μmol/L)、间接胆红素(indirect bilirubin，IBIL；参考值0～13.7 μmol/L)、胆汁酸(total bile acid，TBA；参考值0～10 μmol/L)。出院后定期于门诊随诊复查上述指标。

1.2.3高通量测序 取患儿及父母外周血3 mL，置于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管中送至北京麦基诺基医学检验公司进行遗传代谢性肝病573个基因panelV2检测，目标基因片段通过第2代高通量测序仪进行测序；突变基因依据美国医学会遗传学与基因组学会(american college of medical genetics and genomics，ACMG)发布的变异解读指南进行致病性分析。

1.2.4危害性预测 发现明确或可疑与临床表型相关的基因突变时，对患儿突变基因与其父母基因进行Sanger验证，并运用Rare Exome Variant Ensemble Learner(REVEL)、Sortig Intolerant from Tolerant(SIFT)、PolyPhen-2、Mutationtation Taster、Genomic Evolutionary Rate Profiling(GERP+)5种生物信息学蛋白功能综合性预测软件对突变位点进行危害预测。

1.2.5随访 出院后于消化科门诊随访1年，每次复诊当日空腹抽取静脉血5 mL进行ALT、AST、TBA、TBIL、DBTL及IBIL等肝功能指标检测。

2 结果

2.1 一般情况

11例基因检测确诊的NTCP缺陷病患儿男性6例(54.5%)、女性5例(45.4%)，男女比例1.2 ∶1，就诊年龄3～219 d、平均(60.37±71.20)d，确诊年龄40～221 d、平均(99.82±69.63)d，混合喂养5例、人工喂养1例及母乳喂养5例，因黄疸就诊3例、腹泻就诊1例、体检发现肝功能异常就诊2例、当地新生儿科住院发现TBA升高转诊本院5例，患儿直系亲属中有肝衰竭病史1例、母亲孕期合并高TBA血症1例、余9例家族史无特殊，新生期出现黄疸4例(其中有1例诊断新生儿ABO溶血)、7例无黄疸。

2.2 肝功能情况

11例NTCP缺陷病患儿中ALT升高占比72.7%(8/11)，AST升高占比72.7%(8/11)，TBA升高占100%(11/11)，TBIL升高占比54.5%(6/11)，DBIL升高占比63.6%(7/11)，IBIL升高占比36.4%(4/11)；NTCP缺陷病患儿都存在单项或多项肝功能指标异常，但都存在TBA升高；肝功能指标除TBA外，余各项指标在随访过程中呈下降趋势(病例1、5患儿失访)，随访4～8周后，ALT、AST、TBIL、DBIL及IBIL恢复正常有5、4、2、1及2例，TBA在治疗后一段时间内仍呈高水平，但随着随访时间延长TBA总体呈下降趋势。见表1和图1。

表1 NTCP缺陷病患儿治疗前的肝功能指标Tab.1 Pre-treatment liver function indicators in children with NTCP deficiency

注：A～F分别为ALT、AST、TBA、TBIL、DBIL及IBIL随访情况；P表示病例，数字为病例顺序号，其中P1、P5表示失访。图1 NTCP缺陷病患儿随访期间的肝功能变化Fig.1 Changes in liver function during follow-up of children with NTCP deficiency disease

2.3 基因分析

11例NTCP缺陷病患儿基因测序结果显示，染色体chr14:70245193上SLC10A1基因均存在相同突变位点，系第800号核苷酸由胞嘧啶C变为胸腺嘧啶T(c.800C>T)的纯合突变，上述突变导致第267号氨基酸由丝氨酸变为苯丙氨酸(p.S267F)，属于错义突变；与父母基因比对，结果显示11例NTCP缺陷病患儿基因突变均来源于父母双方，父母均为SLC10A1基因(c.800C>T)突变携带者。见图2。

注：红色曲线表示胸腺嘧啶T，黑色曲线表示鸟嘌呤G，绿色曲线表示腺嘌呤A，蓝色曲线表示胞嘧啶C；红色箭头表示变异位点定位。图2 病例1号与父母SLC10A1基因的Sanger验证Fig.2 Sanger validation of SLC10A1 gene between case 1 and parents

2.4 突变位点危害性的生物信息学预测

所有NTCP缺陷病患儿SLC10A1基因(c.800C>T)经REVEL软件预测结果为良性，经SIFT、P0lyPhen-2、Mutationtation Taster、GERP+预测结果均为有害。

2.5 其他变异信息

11例NTCP缺陷病患儿除检测到与疾病表型高度相关的SLC10A1基因(c.800C>T)突变外，还检测到与临床相关性不明确位点134个，这些基因与肝豆状核变性、高密度脂蛋白缺乏病、Gilbert综合征等多种疾病有关，其中UGT1A1基因(c.211G>A，p.G71R)在11名患儿中出现频率最高(4/11)，该基因突变表型与Gilbert综合征、Crigler-Najjar综合征、家族性暂时性新生儿高胆红素血症有关，且以黄疸为主要表现、IBIL升高为主、通常不伴TBA的升高，但本研究中携有UGT1A1基因(c.211G>A)突变的病例中，2例有黄疸表现，但血生化以DBIL升高为主，且TBA明显升高，故与患儿的临床表型不相符。见表2。

表2 NTCP缺陷病患儿与临床相关性不明确的突变位点结果Tab.2 Results of mutation loci with unclear clinical relevance in children with NTCP defect

注：—表示未检测出。

3 讨论

NTCP是肝细胞发挥Na+依赖吸收功能的主要转运蛋白，转运结合与非结合性TBA，在TBA的转运过程中发挥关键性作用，对前者更具有亲和力[14]。研究显示，NTCP还可作为乙肝及丁肝病毒进入肝细胞的受体，人类SLC10A1基因突变使NTCPTBA转运功能障碍，血中TBA升高导致NTCP缺陷病的发生[15-16]；另一方面SLC10A1基因突变可消除甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)或丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)感染肝细胞的能力[17]。本研究11例确诊NTCP缺陷病患儿，确诊年龄40～221 d，男孩多于女孩。关于NTCP缺陷病的临床表现报道存在差异，Vaz等[7]研究显示NTCP缺陷病例表现为肌张力减低；Liu等[18]研究则提示为25(0H)D缺乏；孙文君等[8]研究显示2例患儿中1例黄疸，血清25(OH)D缺乏，1例表现为生长发育落后。本研究因黄疸首次就诊者3例，肝功能指标以TBA、ALT、AST、DBIL及TBIL升高为主，临床表现、实验室检查与肝细胞性黄疸患者相似，入院初诊为婴儿胆汁淤积性肝病；另有部分患儿因其他系统疾病或体检发现TBA升高，无瘙痒等高TBA中毒表现，临床上易漏诊。研究显示NTCP缺陷与新生儿期高胆红素血症和部分婴儿早期的胆汁淤积有关[2-4]。发生机制与 NTCP缺陷病在肝细胞基底侧膜上的另一种转运蛋白有机阴离子转运多肽1B1(organic anion transporting polypeptide 1B1，OATP1B1)/有机阴离子转运多肽1B3(organic anion transporting polypeptide 1B3，OATP1B3)的代偿作用有关，OATP1B1/OATP1B3蛋白特异性底物范围广泛，能将血浆中的非结合TBA、胆红素、内源性激素、外源性毒性物质摄入肝脏[19]，缓解NTCP缺陷导致的高TBA环境，但是NTCP缺陷病患儿明显升高的血浆TBA又可竞争性抑制OATP1B1/OATP1B3摄取胆红素的功能，导致胆红素继发性升高[9-10]。

目前NTCP缺陷病经报道的SLC10A1基因突变位点有c.(800.C>T)、c. 755G >A (p.Arg252His)、c.615-618del(p.Ser206Profs*12)、c.263T>C(p.lle88Thr)及c.595A>C(p.Ser199Arg)，近期国内还报道了2种新的致病突变c.374dupG和c.682_683delCT，目前SLC10A1突变基因谱在不断更新[1，4，7，11]。自2015年国外报道首例NTCP缺陷病儿童病例以来，截至目前，我国共报道了80余例NTCP缺陷病儿童[1，5，9，12-13，18，20]，约94.5%的患儿SLC10A1上存在c.800C>T纯合突变[21]。本研究11例NTCP缺陷患儿均为SLC10A1 c.800C>T(p.Ser267Phe)纯合突变，其父母均为c.800C>T(p.Ser267Phe)的突变基因携带者，表明c.800C>T(p.Ser267Phe)是SLC10A1高频突变位点。目前报道的病例大部分为纯合突变，少部分为杂合突变，Dong等[20]研究中13例NTCP缺陷儿童中c.800C>T(p.Ser267Phe)纯合突变12例，c.812A>G(p.Asn271Ser)复合杂合突变仅1例。

NTCP缺陷病目前尚缺乏确切的治疗手段，临床以对症治疗为主[3]。本研究结果显示，NTCP缺陷病患儿肝功能指标呈单项或多项指标异常，TBA升高为共同特征。根据患儿具体情况，个体化的选择治疗方案：当严重肝酶升高时，使用保肝药物复方甘草酸苷、还原型谷胱甘肽、葡醛内酯等联合熊/鹅去氧胆酸、消胆胺等利胆药物治疗；当胆汁淤积时使用保肝、利胆药物，予高三酰甘油配方奶粉喂养，口服益生菌、补充脂溶性维生素并联合使用利胆药物治疗。此外，本研究NTCP缺陷病患儿门诊随访结果提示：肝酶、胆红素等指标在短期内降至正常，TBA波动幅度较大，但最终呈下降趋势，总体治疗效果良好。有研究指出OATP1B1/OATP1B3蛋白表达量可随年龄增长而增加，推测其对NTCP缺陷的代偿作用随年龄增长而增强[22]。同时，生后1岁时分子翻译后的糖基化过程对于NTCP在肝细胞膜基底侧的正确定位至关重要，推测NTCP缺陷病患儿TBA可能不会无限升高，可能随着年龄增长逐渐改善[23]。

关于NTCP的表达与调控，法尼醇受体及其他核受体使肝TBA转运蛋白发生适应性转录调节，下调NTCP、减少TBA摄取，并诱导替代性基底外侧流出蛋白有机溶质转运体α/β(organic solute transporter α/β，OSTα/β)、多重耐药相关蛋白3(multidrug resistant associated 3，MRP3)等促进TBA外排，缓解高浓度TBA对肝细胞的损害[24-25]。此外，国外研究表明，牛磺石胆酸(taurolithocholic acid，TLC)可持久抑制NTCP蛋白的表达，而环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)能通过促使容纳NTCP蛋白的细胞囊泡进入肝细胞膜迅速上调NTCP蛋白的表达[26]。

NTCP缺陷病共同特征为顽固性高TBA血症，由于部分儿童病例表现为胆汁淤积使黄疸成为相对常见的NTCP缺陷病首诊原因，而成人病例中大都无症状，少部分育龄期女性表现为妊娠期肝内胆汁淤积症，导致剖宫产率的增加[27]。因缺乏阳性症状导致本病识别困难，可能是目前NTCP缺陷病报道较少的原因之一。

目前随着对NTCP分子机制深入的研究，不断有新的变异位点被发现，丰富了SLC10A1基因变异谱，引起人们对本病的更多的重视；目前尚未出现有关本病导致肝硬化、肝衰竭等终末期肝病的报道，结合其代偿机制OATPlBI/OATPlB3表达量呈年龄依赖性增加的特点，关于NTCP缺陷病是否需要积极治疗还存在疑问，对其远期预后的判断可能需要一个较长的观察随访过程。