基于RNA-Seq技术的真菌病毒AfPV1感染对寄主黄曲霉基因表达的影响*

2022-12-23江银辉杨碧刘翔田询禹文峰齐晓岚吴昌学

贵州医科大学学报 2022年12期

江银辉，杨碧，刘翔，田询，禹文峰，齐晓岚，吴昌学

(贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室 & 贵州省医学分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004)

真菌病毒是寄生在各种丝状真菌和酵母中的病毒[1]。自从第1个真菌病毒在双孢菇中发现以来，研究者在不同种类的真菌中都发现了真菌病毒[1-2]。目前已知真菌病毒的基因组大多数为双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)，也有单链RNA(single-stranded RNA，ssRNA)，少数为单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)[3]。通常情况下，真菌病毒不会影响宿主真菌的表型，但也有些病毒会对宿主表型产生了较大的影响[3-4]。在酿酒酵母中，研究人员发现感染辅助病毒L-A和杀手病毒的菌株可以分泌1种毒素，该毒素可以抑制其他未感染的酵母菌株[5]。感染真菌病毒Talaromycesmarneffeipartitivirus 1(TmPV1)的马尔尼非青霉菌(Talaromycesmarneffei,T.marneffei)增强了对小鼠的致病力[6]；而真菌病毒诱导烟曲霉(Aspergillusfumigatus,A.fumigatus)减弱了对小鼠的致病力[7]。RNA测序(RNA-sequencing，RNA-seq)已被广泛用于揭示生命现象的分子机理，也被用于研究病毒感染对宿主影响的分子机理[3, 8]。对真菌病毒而言，比较转录组分析能够显示病毒感染和病毒脱毒菌株之间的基因表达差异，比如感染A.fumigatus的病毒Apergillus chrysovirus 41362(AfuCV41362)、感染葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea,B.dothidea)的病毒B.dothideachrysovirus 1和病毒B.dothideapartitivirus 1、感染板栗疫病菌的病毒Cryphonectriahypovirus1(CHV1)、感染小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum,F.graminearum)的病毒F.graminearumhypovirus及病毒F.graminearumvirus 1等[9]。这些研究表明，真菌病毒的感染可以影响宿主真菌的许多重要生物学过程，包括代谢、转录调控、信号转导、物质运输、毒力因子表达和核糖体功能[10]。黄曲霉(Aspergillusflavus,A.flavus)是一种条件致病菌，在免疫功能缺陷的人群中引发曲霉感染[11]；此外，A.flavus还会产生具有强烈致癌的次级代谢产物A.flavus素[12]。近年来，发现A.flavus容易对现有抗菌药物产生耐药性[13]。因此，迫切需要新的治疗策略控制A.flavus的感染。随着越来越多的真菌病毒被发现能够选择性感染致病真菌，真菌病毒作为生物治疗，已显示出的巨大潜力[14]。本课题组前期研究分离得到一株能够引起A.flavus表型严重衰退、孢子产量减少和生长速度减慢的真菌病毒A.flavuspartitivirus1(AfPV1)[15]。真菌病毒AfPV1为双分病毒科家族成员，病毒颗粒直径约为40 nm，AfPV1基因组为3条dsRNA片段(dsRNA 1长度为1.7 kbp，dsRNA 2长度为1.4 kbp，dsRNA 3长度为1.1 kbp)[15]。为了阐明AfPV1感染引起寄主A.flavus表型改变的分子机理，本研究利用RNA-Seq技术分析真菌病毒AfPV1对寄主A.flavus基因表达的影响，并从转录组分析AfPV1与寄主A.flavus互作的分子机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1菌株及培养基A.flavus菌株LD-F1(不携带任何病毒并标记嘧啶磺胺抗性)、LD-F1-b(病毒AfPV1感染菌株LDF1获得)，AfPV1(NCBI GenBank No. MK344768，No. MK344769，No. MK344770)，以上A.flavus菌株和AfPV1病毒由本课题组前期获得。所有A.flavus菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA，土豆200 g、葡萄糖20 g及琼脂粉12～15 g，蒸馏水定容至1 000 mL)，121 ℃灭菌20 min，平板30 ℃培养，4 ℃保存于PDA平板上。

1.1.2主要试剂和仪器 TRIZOL(美国invitrogen)，实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂(大连宝生物)；超净台(苏州金净净化)，生化培养箱(天津赛得利斯)，冷冻高速离心机(美国GENE)，PCR扩增仪(美国Applied Biosystem)，Agilent 2100(美国agilent)，分光光度计和Qubit 2.0(美国thermo)。

1.2 实验方法

1.2.1A.flavus菌株RNA提取与质量检测A.flavus菌株LD-F1和LD-F1-b分别接种于铺有灭菌玻璃纸的PDA培养基上，30 ℃培养5 d；收集每个菌株的菌丝；使用TRIzol试剂提取A.flavus菌株的总RNA；称取菌丝0.5 g，置于提前用0.1%焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)溶液处理过的研钵中，加液氮研磨成粉末。将研钵中的粉末用药勺转移至无RNA酶的离心管中，加TRIzol试剂1 mL和氯仿0.2 mL，剧烈震荡混合，置于冰上静置5 min，12 000 r/min于4 ℃离心10 min，取上清，转入新的无RNA酶的离心管，加等体积异丙醇，上下颠倒混匀，于-20 ℃条件静置2 h以上，12 000 r/min于4 ℃离心15 min，弃上清，加75%乙醇1 mL洗涤沉淀，12 000 r/min于4 ℃离心15 min，弃上清，得到RNA沉淀；RNA沉淀于室温条件下干燥，加无RNA酶污染的去离子水20 μL溶解，-80 ℃保存；取RNA样品2 μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测条带类型，Agilent 2100检测RNA样品的完整性；用Qubit和NanoDrop-2000分光光度计对RNA进行浓度和纯度检测。

1.2.2文库构建和RNA-SeqA.flavus菌株RNA样本由Novogene公司通过Illumina HiSeq 2000进行高通量测序，每个样品3个重复；样品RNA检测合格，mRNA纯化，打断成小片段，用随机引物进行反转录合成第1链互补DNA(complementary DNA，cDNA)，合成第2链cDNA链，纯化双链cDNA，PCR富集得到最终的cDNA文库；使用Qubit 2.0对构建好的cDNA文库进行初步定量，用Agilent 2100对待测文库中的插入片段长度进行准确测定，最后使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)方法对cDNA文库的有效浓度进行准确定量(有效浓度>2 nmol/L)；cDNA文库检测合格后，将不同文库按照浓度要求和测序数据量要求进行测序。

1.2.3序列分析 (1)通过去除低质量碱基和污染序列，将原始测序数据进行过滤，然后以美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/360?genome_assembly_id=968150)的A.flavus菌株NRRL 3357的参考基因组；(2)基于P<0.05，通过比较Reads Per Kilobase Per Million mapped Reads(RPKM)的差异获得A.flavus差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)；(3)对A.flavus的DEGs进行基因本体(gene ontology，GO)注释和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)进行功能富集分析。

1.2.4qRT-PCR分析随机挑选A.flavus12个基因，采用qRT-PCR方法进行相对表达量验证。qRT-PCR在实时荧光定量PCR检测系统中，使用TB Green®Premix Ex TaqTM进行；PCR反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s，共40个反应循环；在每个PCR反应结束时分析每个基因的熔体曲线，A.flavus肌动蛋白基因(7910404)作为内参基因。检测基因相对表达量的引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.3 统计学分析

差异基因统计使用DESeq软件进行标准化，然后进行负二项分布分析，使用Benjamini和Hochberg的方法对P值进行调整，调整后log2(foldchange)的绝对值大于1(P<0.05)，则认为基因表达具有差异；GO富集分析采用的软件Goseq，基于Wallenius非中心超几何分布模型通过对基因长度的偏好性进行估计，计算出GO条目中差异基因富集的概率；KEGG显著性富集分析以KEGG数据库中基因信号通路为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比较存在差异表达基因中显著性富集的通路，富集因子越大，表示富集的程度越大；q值是做过多重假设检验校正之后的P值，范围为0～1，越接近于零，表示富集越显著；qRT-PCR数据采用软件GraphPad Prism 7.0进行统计学分析，以均数表示。

2 结果

2.1 RNA质量

样品菌株LD-F1和LD-F1-b的总RNA条带清晰，无污染(图1)；RNA完整性(RNA integrity number，RIN；RIN值介于6～8)好，总RNA纯度良好(OD260/OD280介于1.8～2.0)，样品质量满足测序建库要求(表2)。

注：M为DNA marker，1为菌株LD-F1的RNA，2为菌株LD-F1-b的RNA图1 样品RNA琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RNA samples

表2 样品RNA质量Tab.2 Quality of RNA samples

2.2 测序数据质量

样品测序结果可靠，错误率仅为0.02%，每组样品的clean read的数据大于4 Gb，Q20>96%，Q30>90%(表3)；测序的结果能够成功比对到A.flavus的基因组序列(>56%)，多匹配位点<2%，唯一匹配位点>56%，测序结果符合后续序列分析(表4)。

表3 测序数据质量Tab.3 Quality of sequencing data

表4 Reads与参考基因组比对情况Tab.4 Comparison between reads and reference genome

2.3 DEGs分析

与A.flavus菌株LD-F1相比，菌株LD-F1-b有4 127个 DEGs，其中被上调表达的基因为1 864个，被下调表达的基因为2 263个(图2)；DEGs的GO注释结果显示了30个最显著的GO，其中包括氧化还原过程、单生物过程、单生物代谢过程、跨膜转运、谷氨酰胺家族氨基酸代谢过程、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成过程、二羟酸代谢过程、单生物转运、谷氨酸代谢过程、单生物定位、生物过程、谷氨酸生物合成过程、二羟酸生物合成过程、色氨酸代谢过程、Indolalkylamine代谢过程、含吲哚化合物的代谢过程、氨基酸代谢过程等18个生物过程，1个细胞组分(细胞投射部分)，氧化还原酶活性、催化活性、作用于配对供体的氧化还原酶活性、血红素结合、谷氨酸合酶活性(glutamate synthase activity)、单氧酶活性、四吡咯结合、辅酶结合、FAD结合、辅因子结合、作用于L-氨基酸多肽酶活性、铁离子结合等12个分子功能(图3)。KEGG富集分析结果显示，DEGs参与的KEGG代谢通路中最显著的有20条，分别为酪氨酸代谢、色氨酸代谢、淀粉和糖代谢、丙酮代谢、苯丙氨酸代谢、戊糖与葡萄糖醛酸互相转换、核苷酸切除修复、非同源重组末端连接、氮代谢、错配修复、吲哚二萜生物碱的生物合成、同源重组、乙醛酸和二羧酸代谢、半乳糖代谢、叶酸生物合成、脂肪酸降解、DNA复制、生物素代谢、次级代谢产物的生物合成及碱基切除修复(图4)。

注：红色表示上调表达的基因，绿色表示下调表达的基因，蓝色表示变化不显著的基因。图2 DEGs火山图Fig.2 Volcano plot of DEGs

2.4 DEGs表达

从DEGs中随机挑选12个基因，其中7个上调表达的基因，5个下调表达的基因；qRT-PCR的验证结果显示，与转录组测序结果变化趋势一致(图5)，表明转录组数据真实可靠。

3 讨论

随着大量使用广谱抗生素，对肿瘤患者进行放疗化疗，以及对器官和干细胞移植的患者免疫抑制剂的使用，免疫力低下人群逐渐增多，导致曲霉病的发生率逐年升高[16]。A.flavus不仅是感染人和动物的条件致病菌，而且是很多植物的致病菌[16]。同时A.flavus能够产生具有强烈致癌作用的A.flavus素B等次级代谢产物，严重威胁人类健康[17]。目前只有抗真菌药物用于治疗A.flavus感染，但容易引起耐药菌株产生[18]。真菌病毒是一种选择性感染真菌的病毒，有些真菌病毒能够引起寄主致病力衰退，因此具有治疗病原真菌感染的潜力[15]。目前真菌病毒已经应用于一些植物病原真菌的防治[19]，但未见应用于治疗动物和人的真菌感染。本研究中，真菌病毒AfPV1的感染能够引起寄主真菌A.flavus表型严重的衰退，具有治疗A.flavus的潜力[15]。本研究对真菌病毒AfPV1调控A.flavus的差异基因进行分析，为获得抗A.flavus潜在靶点提供参考。

虽然真菌病毒在真菌中广泛存在，但其与宿主之间的相互作用机制尚不清楚。通过研究板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica,C.parasitica)的真菌病毒，研究者发现RNA沉默是寄生C.parasitica抗病毒防御的机制之一[20]。C.parasitica的RNA沉默途径的基因突变以后，增加了C.parasitica对真菌病毒感染的易感性，同时病毒蛋白p29被认为是真菌中RNA沉默介导的病毒防御的抑制因子[21]。RNA-seq能够提供真菌病毒与寄主真菌相互作用机制的全面信息[3, 8]。通过比较相同基因型背景下，含有真菌病毒和不含真菌病毒的菌株转录组的差异，可以揭示由于真菌病毒感染引起寄主真菌症状的机制[8-9]。但是关于真菌病毒感染引起寄主真菌转录或转录后翻译变化的研究并不多，其中包括A.fumigatus、板栗疫病菌C.parasitica、褐座坚壳菌Rosellinianecatrix、核盘菌Sclerotiniasclerotiorum和禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum[22-24]。尽管如此，大多数情况下真菌病毒调控的基因表达途径的确切性质仍不清楚[25]。本研究通过比较含有真菌病毒AfPV1和不含AfPV1的菌株的转录组，得到4 127个DEGs。对这些DEGs进行GO注释和KEGG富集分析，结果表明DEGs涉及A.flavus的氧化还原过程、单生物过程、单生物代谢过程、跨膜转运、谷氨酰胺家族氨基酸代谢过程、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成过程、二羟酸代谢过程及血红素结合等；这些DEGs参与A.flavus代谢通路中的戊糖、葡萄糖醛酸转换、非同源重组末端连接、氮代谢、错配修复、同源重组、DNA复制、次级代谢产物的生物合成及碱基切除修复等。这些基因代谢途径可能参与真菌病毒与寄主真菌互作的分子机理，但需要做进一步的基因功能验证。