肉芽肿性乳腺炎患者结核硬脂酸棒状杆菌毒力因子和耐药性分析

宋皓月， 舒 文

（上海市第一人民医院检验医学中心，上海 201620）

棒状杆菌属于革兰阳性菌，大多为条件致病菌。结核硬脂酸棒状杆菌因可产生结核硬脂酸（10-甲基十八烷酸）而有别于其他棒状杆菌[1]，临床较为少见。近年来，随着分离、鉴定水平的提高，国外已有关于结核硬脂酸棒状杆菌引起肉芽肿性乳腺炎的报道[2-3]，但我国尚未见相关报道。本研究对分离自肉芽肿性乳腺炎患者脓液样本的结核硬脂酸棒状杆菌的耐药性和毒力因子携带情况进行分析，为临床诊治此类少见菌感染提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集1株上海市第一人民医院分离自无菌环境下穿刺抽取的乳腺脓液样本的棒状杆菌。质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）、肺炎链球菌（ATCC 49619）购自上海市临床检验中心。

1.2 方法

将穿刺所得乳腺脓液样本接种于血琼脂平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司），35 ℃5% CO2培养48 h，观察菌落形态。将脓液样本分别注入需氧和厌氧血培养瓶（美国BD公司）培养5 d，采用法国生物梅里埃公司VITEK MS微生物质谱鉴定系统对培养所得微生物进行鉴定，并进行全基因组测序。采用纸片扩散法和E-试验对培养所得微生物进行药物敏感性检测；E-试验纸条购自杭州康泰公司，相关药物敏感性纸片购自英国Oxoid公司。万古霉素、环丙沙星、利福平、利奈唑胺、亚胺培南、美罗培南药物敏感性结果参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute ，CLSI）M45-A文件[4]标准解读；青霉素、四环素药物敏感性结果参照2021年欧洲药物敏感性试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）[5]标准解读；头孢类药物敏感性结果参照CLSI M100文件[6]中链球菌属的标准解读，庆大霉素、左氧氟沙星药物敏感性结果参照CLSI M100文件[6]中金黄色葡萄球菌的标准解读。

2 结果

2.1 微生物培养结果

穿刺所得脓液样本于血琼脂平板35 ℃ 5%CO2环境培养48 h后，可见白色、乳酪样、无溶血的小菌落（图1）。该菌于厌氧环境中可生长。脓液样本在需氧和厌氧的血培养瓶培养5 d未见菌落生长。

图1 脓液样本培养48 h菌落形态

2.2 革兰染色结果

挑取培养所得菌落，革兰染色后于镜下观察，可见革兰阳性短杆菌，排布散乱，呈并列或V字形排列。见图2。

图2 培养阳性菌落革兰染色镜下形态（×1 000）

2.3 菌株鉴定结果

MALDI-TOF MS鉴定结果显示，根据特征峰解读，该菌株为结核硬脂酸棒状杆菌（置信度99.9%）。见图3。

图3 结核硬脂酸棒状杆菌MALDI-TOF MS 质谱图

2.4 药物敏感性试验结果

该结核硬脂酸棒状杆菌在MH琼脂平板不生长，药物敏感性分析结果显示，该菌株对红霉素、克林霉素、复方磺胺甲噁唑、磷霉素表现为耐药，对左氧氟沙星表现为中介，对其他抗菌药物均表现为敏感。见表1。

表1 结核硬脂酸棒状杆菌药物敏感性分析结果

2.5 耐药基因和毒力因子分析结果

全基因组测序结果显示，该结核硬脂酸棒状杆菌携带多种耐药基因和毒力因子。耐药基因包括β-内酰胺类耐药基因blaTEM、大环内酯类耐药基因erm（X）、氟喹诺酮类耐药基因gyrA和gyrB、利福平耐药基因rpoB和rbpA、氨基糖苷类耐药基因TlyA和rpsL、链霉素耐药基因rpsL和gidB。毒力因子包括铁离子调控蛋白DtxR、（p）ppGpp合成相关蛋白RelA、双组分信号转导系统TcrX和PhoP、菌毛组分蛋白SpaE和SpaF。

3 讨论

一般情况下，结核硬脂酸棒状杆菌在人体皮肤和黏膜表面作为一种正常定植菌存在。有研究结果显示，该菌可能导致炎症性乳房疾病、胰腺脂膜炎、慢性鼻窦炎和手术部位感染等[7]。本研究中，乳腺穿刺脓液在需氧和厌氧血培养瓶内培养5 d仍为阴性，与相关文献[8]结果一致。可能与结核硬脂酸棒状杆菌的亲脂性有关，血培养瓶中主要的营养物质为大豆酪蛋白消化肉汤，不能为该菌株的生长提供丰富的脂质，不利于其生长。

本研究中的结核硬脂酸棒状杆菌分离自1例肉芽肿性乳腺炎患者乳腺脓液样本。目前，肉芽肿性乳腺炎的发病机制尚不完全明确，可能与自身免疫、细菌或病毒感染等有关。有研究发现，棒状杆菌属可能参与了超敏反应，并诱导了肉芽肿的形成[9-10]。

常规实验室理化检测鉴定棒状杆菌属存在一定困难，需要使用MALDI-TOF-MS或其他更为先进的鉴定方法。本研究在分离菌株后，采用MALDI-TOF-MS进行鉴定，置信度为99.9%。

因棒状杆菌尚无明确、全面的药物敏感性判断折点，本研究联用多种标准，以进行更合理的结果判读，结果显示，分离的菌株对红霉素、克林霉素、复方磺胺甲噁唑、磷霉素均耐药，对左氧氟沙星中介，对β-内酰胺类（青霉素、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟、亚胺培南、美罗培南）和庆大霉素、万古霉素、利奈唑胺等均表现为敏感，与相关文献[8]结果基本一致。本研究全基因组测序分析发现该菌携带6种耐药基因。大环内酯类耐药相关的核糖体甲基化酶基因erm主要分为A、B、C、X型，本研究分离菌株为X型，多见于双歧杆菌和棒杆菌属；X型主要作用机制是使大环内酯类、林可酰胺类药物作用的核糖体蛋白甲基化，菌株表现出对红霉素、克林霉素耐药[11-12]，本研究的药物敏感性分析结果与其相符。氟喹诺酮类耐药基因gyrA、gyrB的耐药决定区出现突变，编码蛋白与喹诺酮药物结合能力下降，是菌株对喹诺酮耐药的主要原因[13]。本研究分离菌株对左氧氟沙星中介，其耐药机制还有待于进一步探究。此外，本研究还检测出β-内酰胺类耐药基因TEM、利福平耐药基因rpoB和rbpA、氨基糖苷类耐药基因TlyA，但均未表现出相应药物的耐药性，这可能与相应的基因未被激活，不能产生相关活性蛋白有关[12，14-15]。本研究分离菌株对复方磺胺甲噁唑和磷霉素表现为耐药，但未检测到相关耐药基因，可能存点突变或膜通透性[2]改变等其他未检出的耐药机制。本研究分离菌株携带链霉素耐药基因rpsL和gidB，但缺乏相关判读标准，无法判断其药物敏感性[16-17]。临床耐药情况与耐药基因检测结果不完全相符的原因可能为：（1）本研究药物敏感性分析为体外试验，与临床实际可能存在一定差异；（2）棒状杆菌属药物敏感性判断标准目前仍不完善，很多抗菌药物仍无判读标准，本研究中部分抗菌药物参考了其他菌属的判读标准，结果可能存在一定的偏差。

本研究全基因组测序检出6种毒力因子，包括DtxR、RelA、TcrX、PhoP、SpaE、SpaF。DtxR是铁离子依赖的毒素调节蛋白，通过参与细菌的铁离子负向调控转运来保护细菌，避免其氧化受损[18]。RelA作为核糖体蛋白，可以催化合成（p）ppGpp，抑制RNA的合成，诱导其降解途径，并参与调节DNA复制的基因表达[19]。TcrX与TcrY为双组分系统，TcrY通过四股螺旋束形成二聚体，自身发生磷酸化将磷酸基传递给TcrX，两者间的相互作用可能与某种信号的传递相关[20-21]。PhoP和PhoQ同样为双组分系统，由感应蛋白PhoP和反应调控蛋白PhoQ共同组成，菌体借此感知外界微环境中H+、抗菌肽、Mg2+的变化，直接或间接协调数百个毒力基因的表达，以抵御宿主免疫系统的捕杀，与致病力密切相关[22]。本研究2种双组分结构均只检出单一结构，可能与检测方法的局限性有关。SpaE和SpaF均为SpaD型菌毛小亚单位组分，属于菌体表面菌毛结构，菌体借此黏附锚定于细胞壁表面，使菌体与宿主紧密结合，从而产生致病力[23]。相关毒力因子共同作用，使结核硬脂酸棒状杆菌侵入人体，导致感染。

综上所述，结核硬脂酸棒状杆菌引起的肉芽肿性乳腺炎在我国罕见，可能与该菌具有亲脂性，表现为在普通血平板生长缓慢、血培养瓶中不能生长的生物学特性，以及鉴定方法的限制有一定的关系。本研究从分子水平初步分析了该菌的耐药基因和毒力因子携带情况，并分析了其与表型的吻合度，可为该菌引起的感染性疾病的诊治提供参考。建议临床微生物实验室对此类罕见致病菌多加关注，根据其生物学特性，选择合适的培养方式和鉴定方法，以提高检出率。