尿素循环及其研究进展

乔 瑞，陈 惠，李 乐

（宁夏大学生命科学学院，西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川 750021）

氮（nitrogen）是一种生命元素，是人体蛋白质、DNA和RNA的基本组成部分，体内储积过量的氮会产生有毒的氨，被认为是一种神经毒素，会对机体造成不可逆的损害。因此，机体需要通过尿素循环将氨基酸代谢产生的氨毒经过一系列的生理生化反应转化为无毒的尿素，随后进入血液通过尿液排出体外。尿素循环是哺乳动物和许多两栖类动物在体内代谢产生过量氮的主要方式。当尿素循环中的某一调控酶发生异常突变时，会增加合成嘧啶的氮元素利用率，加强癌细胞中核苷酸物质的合成，促进癌症的发生、发展。本文主要介绍了尿素循环及其相关酶在代谢循环中的作用机制，并讨论靶向尿素循环通路在肿瘤治疗中的价值。

1 尿素循环

尿素循环又称鸟氨酸循环（ornithine cycle），由Krebs等[1]提出，是第一条被完整研究的代谢通路。肝脏中的UC主要由五种调控酶驱动[2]，其具体的代谢途径为：首先，游离于体内的铵根离子（NH4+）与碳酸氢根离子（HCO3-）在氨基甲酰磷酸合成酶1（carbamoyl phosphate synthase 1，CPS1）的催化下消耗ATP合成氨基甲酰磷酸（carbamoyl phosphate，CP），其中N-乙酰-L-谷氨酸（N-acetyl-L-glutamate，NAG）作为别构激活剂参与这一限速反应；其次，CP在鸟氨酸转氨甲酰酶（ornithine transcarbamylase，OTC）的催化下，将氨甲酰基转移给鸟氨酸（ornithine，Orn）后生成瓜氨酸（citrulline，Cit），Cit再通过溶质家族25成员13（SLC25A13）转运出线粒体到达细胞质基质，由此进入了胞质尿素循环。Cit在精氨基琥珀酸合酶1（argininosuccinate synthetase 1，ASS1）的催化下与谷氨酰胺（glutamine，Gln）衍生的天冬氨酸（aspartate，Asp）缩合生成精氨琥珀酸（argininosuccinic acid，ASA），这也是尿素循环的第二个限速反应。精氨基琥珀酸裂解酶（argininosuccinate lyase，ASL）使ASA裂解成精氨酸（arginine，Arg）和延胡索酸（fumarate，Fum），随后Arg在精氨酸酶（arginase，ARG）的催化下水解产生尿素和Orn，Orn又经线粒体鸟氨酸转运蛋白1（ORNT1）从细胞质中转回到线粒体中进行下一轮的尿素循环。其循环通路如图1所示。

图1 尿素循环通路图

2 尿素循环失调及其治疗

当体内尿素循环调控酶发生异常表达时，会增加氮元素用于嘧啶合成的利用率，导致核苷酸不平衡，这一现象被称为尿素循环失调（urea cycle disorder，UCD）[3]。由尿素循环调控酶缺失引起的UCD大多为染色体隐性遗传疾病，新生儿可以通过早期的孕检及时辅佐激素药物治疗，成人可以通过肝脏移植手术等方式治疗。此外，UCD也是癌症中普遍存在的一种代谢异常的现象，尿素循环调控酶的突变对患者而言是一把双刃剑，一方面会促进癌症恶化，减少患者的生存率；另一方面又会产生特殊的新肽蛋白片段使肿瘤对机体免疫系统更加敏感[4]。因此，针对尿素循环调控酶的突变和生化特征对UCD开展研究具有重要的诊断意义。

3 氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS1）

CPS1基因定位于2号染色体长臂（2q34），包含4 500个编码核苷酸、38个外显子与37个内含子，主要表达于肝脏和肠上皮细胞线粒体内膜，分布在细胞质基质中。CPS1的转录由TATA结合蛋白（TBP）激活，其增强子中包含激活蛋白1（AP-1）、CCAAT结合蛋白（C/EBP），以及cAMP反应元件结合蛋白（CREB）、组织特异性因子（如肝核因子3，HNF3）[5-6]等，这些结合位点可以增强CPS1启动子活性，促进CPS1转录，调整体内氨代谢。此外，CPS1的活性还受到DNA甲基化的影响，位于转录起始位点附近的CpG二核苷酸在原发性肝细胞癌（hepatic carcinoma，HCC）细胞中被高度甲基化，抑制了CPS1的启动子活性，使其转录受到抑制，因此可以作为抗癌的一项重要靶点[7]。另外有研究[8]报道，小分子化合物H3B-120通过影响CPS1的ATP-A结构域的活性，抑制嘧啶合成及其代谢物产生，对治疗UCD具有潜在价值。

有研究[9]显示，小鼠肝脏线粒体CPS1大部分的赖氨酸残基会被乙酰化，其中沉默调节蛋白5（recombinant sirtuin5，SIRT5）是烟酰胺腺嘌呤二核 苷 酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）依赖性脱乙酰辅酶，对控制体内的代谢稳态起重要作用。SIRT5通过NAD依赖性方式使CPS1脱乙酰化，直接靶向CPS1翻译后修饰从而加强其酶活性，增强氨基酸的分解代谢[10]；在SIRT5缺失的小鼠中，CPS1的琥珀酰化水平增加，活性降低，使机体血氨浓度升高[11-12]。这些证据都表明SIRT5对调控CPS1酶活具有重要影响。此外，CPS1的活性还受到NAG的绝对正向调控[13]。

CPS1缺失引起的UCD称为氨基甲酰磷酸合成酶1缺陷症（carbamoyl phosphate synthase 1 deficiency，CPS1D）。首先CPS1的缺失会引起UC下游产物的消耗，使CPS1D患者血氨浓度升高、Cit及Arg浓度降低。此外，CPS1也参与嘧啶核苷酸的生物合成，其中间产物为乳清酸，因此CPS1D也可造成乳清酸浓度降低，引发乳清酸尿症（orotic aciduria，OA）。值得注意的是，N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症（N-acetyl glutamate synthetase deficiency，NAGSD）存在着与CPS1D类似的症状，在临床上很难区分，主要依赖酶学或基因检测方法进行鉴别[14]。目前治疗CPS1D的主要方法为降低血氨水平，包括限制饮食中蛋白质的含量、口服L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）、苯甲酸钠和苯乙酸钠等降氨药物；当血氨水平极高时可以进行血液或腹膜透析治疗，待病情稳定后可考虑进行肝移植手术[15]；NAGSD患者通过服用NAG类似物N-氨基甲酰-L-谷氨酸（N-carbamoyl-L-glutamate，NCG）进行治疗也取得了成功。因NAG可作为CPS1的变构激活剂，对CPS1具有绝对的正向调控作用，将NAG应用于CPS1D的治疗来提高尿素的产生，降低血氨的浓度，取得了初步成效[16]，但仍需更多的实验证据支持此结果。

通过TCGA数据库全外显子测序及甲基化分析结果表明，似乎受肿瘤微环境、转录因子、癌基因激活或抑癌基因失活、代谢失衡等多种因素影响，在不同类型的肿瘤中，尿素循环调控酶的表达存在差异性。研究[17]发现，在HEK293细胞中过表达抑癌基因p53可以抑制CPS1、OTC和ARG1等尿素循环调控酶的mRNA表达，导致氨积累进一步抑制鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）mRNA的翻译，从而降低了多胺合成速率和抑制肿瘤细胞的增殖。在KRAS/LKB1双突变（KL）的非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）中检测到CPS1的过表达，且LKB1与CPS1的表达呈负相关，因此LKB1可以通过AMPK抑制CPS1的转录，从而有效阻止病灶的转移[18]。值得注意的是，这种抑制癌症进程的作用不是机体无法进行完整的尿素循环积累氨毒造成的，而是因为CPS1同样也可以参与到嘧啶的生物合成，当LKB1抑制肿瘤细胞内CPS1的表达后，细胞会发生嘌呤/嘧啶比例失衡、复制叉停止和DNA损伤的现象，抑制肿瘤的发生发展。分析胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）的转录组数据发现[19]，CPS1在GBM组织和细胞中甲基化水平低、转录水平高，且CPS1低甲基化水平与GBM患者较短的总生存期相关，提示CPS1可能在GBM进展中发挥作用，并可作为GBM潜在的预后因素和治疗靶点。由此我们可以得知，CPS1除维持肝脏正常的尿素循环功能外，还对一些肿瘤的发生发展起重要作用，为肿瘤精准治疗提供理论依据和用药指导，并有望成为肿瘤早期诊断的新型生物标志物以及预测肿瘤患者预后的潜在指标。

4 鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）

OTC基因位于X染色体（Xp21.1），全长73 kb，包含10个外显子和9个内含子[20]，322个氨基酸构成一个完整的三聚体结构，每个亚基末端都包含结合CP的N末端结构域以及结合L-鸟氨酸的C末端结构域，活性位点位于两个结构域之间[21]，主要表达于肝脏和肠黏膜细胞。在OTC约110 bp的增强子区域有两个HNF-4结合位点和两个C/EBP结合位点。OTC在肠道和肝脏中通过HNF-4与启动子结合诱导组织特异性表达，而HNF-4和C/EBP也会与增强子结合进一步促进OTC的表达[22]。对STRT3敲除鼠的肝细胞研究证明，STRT3也能促使OTC脱乙酰化，提高OTC的活性[23]；通过转录因子P53、TSA和NAM对K88残基位点进行处理可增加OTC的乙酰化水平，抑制其酶活性[24]。

OTC缺失引起的UCD称为鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷症（ornithine carbamoyl transferase deficiency，OTCD），是先天性UCD中最常见的类型，在人群中的发病率较低，多为不完全显性或隐性X连锁遗传病，男性患者相较于女性人数更多，病情更为严重[25]。由于OTC的缺失导致尿素循环过程中氨甲酰基转移给Orn形成Cit的过程受阻，机体内Arg、Cit水平降低，Gln和丙氨酸（alanine，Ala）水平升高，进而导致乳清酸和嘧啶合成增加以及血氨升高。OTCD患者最常见的并发症状为恶心、呕吐和厌食等，同时伴有嗜睡、烦躁、胡言乱语和行为异常等不适症状。随着血氨浓度的升高，患者会出现意识障碍、抽搐、昏迷、呼吸困难和肌无力等症状[26]。目前针对OTCD的治疗主要是以长期饮食控制为主，以低蛋白摄入为基础；同时，也可用药物建立代谢旁路清除体内氨毒，如服用Arg、苯甲酸钠和苯丁酸钠等[27]。在HCC中，OTC的表达与肿瘤进程呈负相关[28]。

5 精氨基琥珀酸合酶1（ASS1）

ASS1基因定位于9号染色体长臂（9q34.1），为同源四聚体结构，全长56 kb，其中3-16为编码外显子，共编码412个氨基酸。ASS1启动子中含有6个特异性蛋白1（SP1）结合位点，有3个GC boxes可以与SP1结合，对ASS1的转录进行协同结合调控[24]。在距ASS1转录起始位点上游10 kb处存在cAMP反应元件（CRE），抑制C/EBPα会使ASS1转录水平下降，从而抑制尿素的生成。ASS1启动子近端区域包含一个E-box区和一个GC区。在正常情况下，缺氧诱导因子（HIF-1α）会结合到E-box区，抑制ASS1转录；而当体内缺乏Arg时，c-Myc可结合到E-box区，特异性蛋白4（SP4）与GC-box结合，促进ASS1的转录[29-30]。ASS1主要表达于肝脏和肾脏中，其表达水平会因细胞的种类、分化程度和作用而不同[31]。婴幼儿肾脏中的ASS1主要表达于近端小管细胞胞质中，方便快速生成Arg；成人肾脏中的ASS1主要表达于细胞质基质中，并且会受到皮质醇、胰岛素、生长激素和胰高血糖素等激素的调控[32]。最新研究[31-33]发现，ASS1及其产物Cit在先天免疫反应中的重要作用，研究者通过诱导巨噬细胞发生炎症后观察到小鼠体内ASS1的水平显著升高，Cit被快速消耗，并且在这一进程中，JAK-STAT信号通路参与了ASS1的转录表达，使ASS1的Y87位点发生磷酸化，提高其酶活性。此外，在BMAL1的协同作用下，昼夜节律相关基因CLOCK（circadian locomotor output cycles kaput）能够直接乙酰化K165和K176位点使ASS1失活[34]。

由ASS1缺失引起的UCD称为精氨琥珀酸合成酶缺陷症（argininosuccinate synthetase deficiency，ASD），又称为瓜氨酸血症1（citrullinem-zia1，CTLN1），是较为严重的UCD之一，甚至会对患者的精神系统造成严重损伤。与其他UCD治疗类似，主要依靠降低血氨水平、停止蛋白质摄入和建立代谢旁路等方式进行治疗，以排出过多的氨。

随着对ASS1在肿瘤发生、发展中作用机制研究的深入，ASS1与肿瘤的增殖、侵袭、转移和预后密切相关，并且ASS1的差异性表达可能导致截然不同的临床结果。在胃癌中ASS1异常表达，会呈现持续性激活的现象，从而促进肿瘤细胞的增殖与迁移[35]。另外，ASS1在结直肠肿瘤中也呈高表达，可以作为原发性结直肠肿瘤的上调靶点，应用抑制剂或敲除ASS1时会削弱结直肠炎的癌变性[36]。在乳腺癌中白介素-17（IL-17）参与ASS1的上调，同时会影响Arg产生NO，促进肿瘤细胞的增殖与侵袭[37]；且ASS1的过表达会抑制肿瘤细胞自噬，促进相关信号因子和转录因子的激活。但是，胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDCA）中的ASS1处于低表达状态，同时组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和精氨酸剥夺剂联合辅佐治疗时，会引起DNA损伤，使细胞周期停滞在S期，导致细胞复制受损进而发生死亡[38]。因此，ASS1在肿瘤中的双重作用机制尚不清晰，需要进一步深入研究其潜在机制。

6 精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）

ASL基因定位于7号染色体q22区域，由17个外显子组成，为同源四聚体结构。ASL通过SP1与正调节剂核因子Y（NF-Y）进行结合，从而激活ASL的转录[39]。ASL主要分布于肝细胞胞质中，在小肠、肾脏、心脏、脾和肺等组织中也有微量表达[40]，但在肌肉组织中几乎不存在。此外，因ASL在肝脏内的特异性较强，可以作为反映肝损伤的重要指标。

ASL缺失引起的UCD称为精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症（argininosuccinate lyase deficiency，ASLD），而ASL缺失可能是由Arg的组织特异性缺乏或ASA的升高而引起的，使患者血浆中的Gln、Ala和Cit升高，其治疗方法与上述几种UCD大致相同。

ASL催化ASA产生的Arg，是一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成NO和Cit的底物，NO是细胞内有效的信号分子，可通过体内浓度变化而对癌细胞进行调节[41]。有研究表明[42]，在肠上皮细胞中ASL的过表达可产生抗炎性NO来防止结肠炎癌变；而低浓度的NO会促进癌细胞的扩散[43]，并促使血管生成和上皮细胞-间充质转化（EMT）过程[44]。另外，Arg可以进一步产生胍丁胺来抑制NOS活性，降低NO的水平，同时提高乙酰化作用限制多胺的产生[45]。在ASS1过表达的结肠癌细胞中，ASL的催化是可逆反应，由ASS1催化生成的ASA，可以驱动ASL生成Arg和Fum；相反ASL活性降低和富集过量的Fum，能使延胡索酸缺陷型骨癌细胞存活更久，但同时会引起精氨酸营养缺陷[46]。

7 精氨酸酶（ARG）

ARG是一种双核含锰的金属酶，ARG的催化活性中心具有两个不同亲和性的金属离子结合位点，活性受到Mn2+的调控[47]，基因定位于6号染色体（6q23），全长969 bp，编码322个氨基酸残基。ARG的转录激活是通过SP1和核因子1（NF-1）/CCAAT结合转录因子（CTF）来完成的[48]。ARG作为一种持续存在于机体而被广泛研究的生物酶类，参与到机体的各项生理病理过程中，进行复杂的代谢反应。

ARG有ARG1和ARG2两种同工酶，两者约有60%的氨基酸序列一致，主要在于各自的表达部位、染色体定位以及免疫反应性之间存在差异。ARG1又称为“肝型ARG”，即在肝脏中有较高的生物学活性，尿素循环中ARG1的产物Orn不仅是尿素循环的代谢物，也是生成脯氨酸（proline，Pro）和Glu的前体[49]。除了尿素循环外，ARG1还参与生成精胺（spermine，Sm）和亚精胺（spermidine，Sd）等合成生物大分子的多胺代谢（polyamine meta-bolism）过程，影响细胞的代谢水平和生长进程。另外ARG1也存在于血管内皮细胞和平滑肌细胞等肝外组织中，并且在不同组织器官中的表达水平与各种心脑血管疾病的发生密切相关。ARG2又称“肝外ARG”，是一种线粒体酶[50]，主要表达于肾脏、脑、小肠、前列腺、乳腺以及巨噬细胞中，因器官分布不同，功能也存在差异性，在人体的新陈代谢、免疫调节等方面发挥重要作用。ARG2除了参与尿素循环和多胺代谢外，同时对NO的合成有调控作用，ARG2与NOS竞争Arg，与炎症反应、高血压等疾病的发生密切相关[51-52]。

ARG缺失引起的UCD称为精氨酸酶缺乏症（argininase deficiency），又被称为精氨酸血症（argininemia）。ARG的缺乏使血液中Arg浓度升高，会引起部分器官的损伤，针对精氨酸酶缺乏症目前还缺乏有效的治疗方法，只能从饮食上控制蛋白质的摄入量。而肿瘤细胞的生长和增殖需要Arg的营养支持，对某些精氨酸营养缺陷型的肿瘤而言，可以通过精氨酸剥夺治疗（arginine deprivation therapy）[53]来治疗该类疾病。目前已经研发出精氨酸脱氨酶（arginine deiminase，ADI）及其类似物ADI-聚乙二醇20（ADI-PEG20），精氨酸酶聚乙二醇重组型rhARG-PEG/BCT-100Z和精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylation，ADC）等几种Arg降解酶用于UCD的治疗。

ARG除作为尿素循环中的代谢酶外，也参与了免疫系统的调节。在巨噬细胞（M2）的诱导下，ARG1在细胞抗炎、肿瘤免疫、肿瘤细胞侵袭以及免疫抑制有关的疾病中发挥重要作用[54]。ARG1的高表达与HCC患者的不良预后密切相关，通过干扰HCC中ARG1的表达，会降低肿瘤细胞的生长[55-56]。Ochocki等[57]发现在肾透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中ARG2和ASS1的表达受到强烈抑制，通过药理学方法恢复酶的表达会使患者生存率提高。McGovern等[58]的研究发现，ARG2的活化会影响骨髓内调节T淋巴细胞产生，介导癌症患者的系统性免疫功能障碍和局部的肿瘤免疫逃避[59]。

综上所述，ARG可通过多种途径影响肿瘤细胞的生物学行为。尿素循环是生物体内一个重要的代谢调控系统，对排出体内氨毒和维持机体稳态起到了重要的作用。近年来代谢异常成为肿瘤研究的热点，其中尿素循环调控和肿瘤的关系逐渐被证实，通过研究尿素循环调控机制可以更深入地了解肿瘤的发生机理，对未来癌症的治疗具有重要指导意义。目前这些研究仍处于起步阶段，随着尿素循环在肿瘤中的生物变化及其靶标研究工作中的进展，通过干预尿素循环来治疗相关疾病有望成为现实。