乳酸发酵提升饲料中水溶性钙的研究
2022-12-21熊晓莉熊屿吾林辉李宁
熊晓莉，熊屿吾，林辉，李宁
(1.重庆工商大学 环境与资源学院，重庆 400067；2.重庆工商大学 环境与资源化学技术国家级实验教学示范中心，重庆 400067)
发酵饲料具有改善鱼虾肠道功能[1-2]及免疫力[3-4]、调理水质[5]、提升诱食效果[6]等作用。乳酸菌常用于饲料发酵，其发酵工艺条件简单，并被世界公认为最为安全的发酵方式[7-9]。本文将含黄粉虫粪的饲料原料中添加贝壳粉，用乳酸混合菌发酵，将贝壳粉中不溶性无机钙转化为有利于生物吸收的可溶性钙。采用两段式发酵工艺，以饲料中可溶性钙含量为指标，在单因素实验基础上进行正交实验，对发酵体系的配方进行优化，为制备具有高可溶性钙含量的虾饲料提供方法。
1 实验部分
1.1 材料与仪器
混合乳酸杆菌(100亿cfu/g)，由菌长生物提供；黄粉虫虫粪(由餐厨垃圾、麦麸、青菜等经黄粉虫过腹转化制得，45目)；豆粕、贝壳粉(100目)、全麦粉均为饲料级；红糖，食品级；黄粉虫虫粉，实验室自制；去离子水。
ICAP-7200 ICP-OES等离子体光谱仪；JY2002型电子分析天平；WKF130万能粉碎机；PHS-3C精密酸度计；TG16-WS高速离心机；SHZ-82恒温水浴摇床。
1.2 实验方法
1.2.1 饲料原料的准备 取黄粉虫粪50份，豆粉20份，黄粉虫幼虫粉10份，全麦粉20份，充分混合均匀，得到饲料原料I。
1.2.2 一段式发酵 将贝壳粉、红糖颗粒、发酵菌剂(粪肠球菌、植物乳酸杆菌按质量比1∶1比例混合，下同)、100份的饲料原料I、去离子水适量，依次加入发酵瓶中，充分拌匀后，密封，将发酵瓶放入恒温培养箱中，温度控制在35 ℃，每3 h摇晃1次发酵瓶，持续96 h。将发酵好的物料烘干，测其水溶性钙含量。
1.2.3 两段式发酵[10]
1.2.3.1 第一阶段：液态发酵 与一段式发酵相同量的贝壳粉、红糖颗粒、发酵菌剂、去离子水，依次加入发酵瓶中，密封后，充分摇匀后，将发酵瓶放入恒温培养箱中，温度控制在35 ℃，每3 h摇晃1次发酵瓶，持续48 h。
1.2.3.2 第二阶段：固态发酵 将液态发酵得到的发酵液与100份的饲料原料I混合均匀，并密封，在35 ℃，厌氧发酵48 h。将发酵好的物料烘干，得发酵饲料，测其水溶性钙含量。若需制成颗粒，也可在发酵过程中加入黏合剂。
1.3 分析方法
1.3.1 水溶性钙含量的测定 取1 g烘干的样品放入50 mL离心管内，加入40 mL去离子水，将离心管固定在水浴摇床上。设置温度70 ℃，振荡速度250 r/min，振荡60 min。离心，取上清液，用 ICP-OES等离子体光谱仪测定[11]。
1.3.2 总钙测定 取1 g烘干的样品放入坩埚中，将坩埚放在110 ℃加热板上，使得饲料炭化至无烟。将坩埚放入马弗炉中，在550 ℃加热3 h。烧制后的粉末用10 mL硝酸溶解，并定容至100 mL，过滤，用ICP-OES等离子体光谱仪测定[12]。
2 结果与讨论
2.1 一段式与两段式发酵效果对比
一段式与两段式发酵效果对比见图1。
由图1可知，随着发酵体系中水的添加量增加，水溶性钙含量不同程度地增加。在两段式的发酵过程中，当水用量小于100 g时，水溶性钙含量增加趋势明显；当水用量高于100 g时，水溶性钙含量增加趋势平缓。而在一段式发酵中，随着物料含水率的增加，水溶性钙含量持续增加，从曲线趋势可预测，若物料的含水率足够高，水溶性钙含量会与两段式接近，但物料含水率过高，不利于后期物料的烘干和造粒。因此，在相同情况下，两段式发酵的效果要优于一段式发酵。故本文仅以两段式发酵进行研究。
图1 一段式发酵和两段式发酵效果Fig.1 Comparison between one-stage fermentationand two-stage fermentation
2.2 单因素实验
2.2.1 贝壳粉添加量对水可溶性钙的影响 去离子水80 g，红糖6 g，发酵菌剂6 g，发酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃ 液态发酵和固态发酵各48 h，考察贝壳粉添加量对饲料中可溶性钙含量的影响，结果见图2。
图2 贝壳粉添加量对可溶性钙产量的影响Fig.2 Effect of shell powder addition onsoluble calcium yield
由图2可知，当贝壳粉的添加量≤5 g时，饲料中水溶性钙的产量迅速增加，这是因为贝壳粉中的碳酸钙与体系中过量的乳酸发生化学反应，故增加贝壳粉的量，可以提高水溶性乳酸钙的生成量。但当贝壳粉的量增加到一定程度后，大量消耗体系中的乳酸，导致发酵体系中乳酸含量过低，不利于碳酸钙转化为乳酸钙。因此，贝壳粉的添加量宜为5 g。
2.2.2 水添加量对水可溶性钙的影响 贝壳粉 3 g，红糖6 g，发酵菌剂6 g，发酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃ 液态发酵和固态发酵各48 h，考察水的添加量对饲料中水溶性钙含量的影响，结果见图3。
图3 水用量对可溶性钙产量的影响Fig.3 Effect of water content on soluble calcium yield
由图3可知，当水的添加量≤100 g时，饲料中水溶性钙的产量迅速增加。这是因为适当的含水量有利于发酵体系充分混合，发酵产生的乳酸与贝壳粉充分接触，使得反应速度增快。当水的添加量 >100 g 时，含水量对生成水溶性钙的影响不明显。
2.2.3 红糖添加量对水可溶性钙的影响 水80 g，贝壳粉3 g，发酵菌剂6 g，发酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃液态发酵和固态发酵各48 h，考察红糖添加量对饲料中水溶性钙含量的影响，结果见图4。
图4 红糖添加量对水溶性钙产量的影响Fig.4 Effect of brown sugar addition onsoluble calcium yield
由图4可知，当红糖的添加量≤4 g时，随着红糖添加量的增加，乳酸钙的产量随之增加。这是因为糖分为菌的生长提供营养，乳酸菌通过代谢将糖分转化为乳酸。但当糖分的添加量>4 g时，乳酸钙的产量随之降低。可能是因为当发酵体系中糖分浓度超过了乳酸菌生长所需要的最佳浓度时，过高浓度的糖分对乳酸菌具有抑制作用，从而降低了乳酸钙的产量，乳酸发酵其他物料的过程中，也观察到近似的现象[13]。因此，红糖的添加量选择为4 g。
2.2.4 发酵菌剂添加量对水可溶性钙的影响 水80 g，贝壳粉3 g，红糖6 g，发酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃液态发酵和固态发酵各48 h，考察发酵菌剂添加量对饲料中可溶性钙含量的影响，结果见图5。
由图5可知，当发酵菌剂的添加量≤6 g时，随着发酵菌剂添加量的增加，乳酸钙的产量随之增加，成品饲料水溶性钙含量也随之增加。这是因为当发酵菌剂添加量过低时，乳酸菌难以形成优势菌种，乳酸菌与其他杂菌相互竞争，导致反应体系中乳酸菌的数量无法快速增加，降低了乳酸的产量。随着发酵菌剂的增加，使得乳酸菌形成了优势菌种，乳酸菌在短时间内快速大量地繁殖，产生了大量乳酸，大量乳酸的存在使得反应体系的pH值快速降低，过低的pH值会抑制乳酸菌生长[14]，同时也对其他杂菌的生长繁殖起抑制作用[15]。当发酵菌剂的添加量>6 g时，乳酸钙的产量基本上不随发酵菌剂的添加量而变化，这是因为发酵体系中营养物质的含量是固定的，只能维持一定数量的乳菌正常生长，当体系中乳酸菌含量达到上限时，乳酸钙的产量也随之达到了上限。
图5 发酵菌剂添加量对水溶性钙产量的影响Fig.5 Effect of fermentation bacteria addition onsoluble calcium yield
2.3 正交实验
采用正交实验法确定两段式发酵的最佳效果，以水溶性钙为指标。液态发酵条件：发酵温度 35 ℃，发酵时间48 h。采用L16(44)正交实验，对液态发酵阶段的贝壳粉添加量、去离子水添加量、红糖添加量和发酵菌剂添加量进行优化，实验因素及水平见表1。液态发酵阶段结束后，将发酵液与发酵原料Ⅰ 100 g充分混合，进入固态发酵阶段，发酵条件：发酵温度35 ℃、发酵时间48 h。将发酵完成的物料烘干，得发酵饲料，测发酵饲料中的水溶性钙含量。正交实验结果见表2。
表1 L16(44)正交因素水平表Table 1 L16(44) Orthogonal factor and level table
表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test
由表2可知，两段式发酵过程，影响饲料中水溶性钙的主次因素是D>A>C>B，液态发酵阶段的最佳配方为：发酵菌剂6 g(D3)、贝壳粉5 g(A4)、红糖5 g(C3)、去离子水140 g(B4)。但因B因素为本实验的最不敏感因素，且B4和B2的k值差别很小，为了饲料成品干燥水分时能量消耗低，故最终选择B2作为该实验的最优条件。在D3A4C3B2的配方组合下进行验证实验，得到发酵产物中水可溶性钙的平均含量为16.08 mg/g(干基)。
2.4 发酵前后饲料中钙含量的对比
对饲料原料Ⅰ、饲料原料Ⅱ、发酵饲料Ⅰ、发酵饲料Ⅱ、商品饲料中水溶性钙和总钙的测定结果见表3。
表3 饲料中钙含量的对比Table 3 Comparison of calcium content in feed
由表3可知，单纯地向饲料原料中添加贝壳粉而不进行发酵处理，只能增加饲料中总钙的含量，不会提升饲料中水溶性钙的含量，并不利于虾对钙的吸收，补钙效果不佳。而某商品中总钙含量虽高，但钙的存在形式也主要以不利于虾吸收的无机钙为主。发酵饲料Ⅱ中的水溶性钙含量为16.08 mg/g，达总钙含量的55.28%，可知通过本实验的发酵过程，大大提升了饲料中水可溶性钙的含量，更有利于虾对钙的吸收利用。
3 结论
采用两段式发酵工艺，对添加有贝壳粉的饲料进行发酵。研究表明，菌接种量、糖、水和贝壳粉的添加量，对发酵后的饲料中的水溶性钙含量均有影响。正交实验得到了液态发酵阶段的最优配方：菌接种量6 g，贝壳粉5 g，红糖5 g和水100 g，在温度35 ℃下发酵48 h后，然后将发酵液与100 g饲料原料混合，再次在35 ℃下发酵48 h，可得到水可溶性钙含量为16.08 mg/g(干基)的饲料，大大提升了饲料中有利于鱼虾生长的水溶性钙的含量，为生产鱼虾水溶性高钙饲料开辟新途径。
