阿魏酸调控心肌肥厚的作用机制

吴 波，张伶俐，陈 醒，王玥坤，魏 玮，高 茗，蓝晓红

(中国人民解放军东部战区总医院 药剂科，江苏 南京 210002)

心肌肥厚(Cardiac hypertrophy)是由高血压、心律失常等多种因素引起的心脏组织结构异常病变，临床表现为心脏体积扩大，冠状动脉血流减少，导致心功能下降，最终引起左心室肥厚。如未及时有效给予干预，最终会导致不可逆转的心力衰竭[1-2]。目前，临床上还未有关于心肌肥厚相关的特效药上市，大多数学者将研究重心放在干预心肌肥厚的发展过程上。阿魏酸(Ferulic acid，FA)是自然界普遍存在的一种酚酸，具有抗氧化、抗菌消炎、抗血栓、降血脂、降低心肌耗氧量、保护妇女卵巢和降低肝损伤等药理作用[3-4]，被广泛应用于医药、保健品、化妆品及食品添加剂中。然而，阿魏酸是否具备干预心肌肥厚的作用鲜有报道。网络药理学(Network pharmacology)基于大数据平台，通过挖掘靶点数据间的差异，阐明“靶点-靶点”间的相互作用关系，被广泛应用于药物机理研究[5]。分子对接技术(Molecular Docking)作为计算机辅助药物设计的一种主要方法，目前已被广泛用于新型药物研发的各个环节[6]。本研究运用网络药理学和分子对接技术挖掘阿魏酸作用于心肌肥厚的相关靶点，在此基础上进行GO和KEGG分析，并对核心靶点进行分子对接验证，以阐明阿魏酸调控心肌肥厚的相关机制。本研究技术路线，见图1。

图1 技术路线

1 材料与方法

1.1 阿魏酸的预测靶点

在台湾中医药资料库(http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/chemical.php)搜索“ferulic acid”，得到关于阿魏酸的相关信息，选择格式为*.mol2保存。将ferulic acid.mol2文件上传到Swiss Target Prediction数据库(http：//swisstargetprediction.ch/)，选择种属为“Homo sapiens”。

1.2 心肌肥厚的相关靶点

在基因序列Gene Card(https：//auth.lifemapsc.com/)平台上搜索“Cardiac hypertrophy”，选择种属为“Homo sapiens”，选择“Relevance score”排名前2 000的基因靶点；在开放靶点平台Open Targets(https：//platform.opentargets.org/)上搜索“Cardiac hypertrophy ”，选择种属为“Homo sapiens”，筛选“over all Association Score”排名前2 000的靶点基因。将上述平台获得的靶点基因进行韦恩图分析，筛选出共同基因靶点[7]。

1.3 构建蛋白互作PPI网络及核心基因Hub筛选

将得到的共同靶点基因上传到STRIN平台(https：//string-db.org/)，选择“Multiple proteins”，organism选择“Homo sapiens”，其他参数保存默认，得到蛋白互作PPI网络图。将string_interactions_short.tsv导入Cytoscape 3.7.2软件，用APP中“MCODE”插件进行Hub基因筛选，按Score进行排序。

1.4 通过David数据库进行GO和KEGG信号通路富集

将“1.2”项得到的共同基因靶点上传到David数据平台(https：//david.ncifcrf.gov/)，选择“Office Gene symbol”，物种选择“Homo sapiens”，进行基因本体(GO)和京都基因百科全书KEGG信号通路富集。

1.5 阿魏酸与核心蛋白的分子对接

在蛋白数据库RCSB(https：//www.rcsb.org/)输入“1.2”项得到的共同靶点，获得各个靶点蛋白及原配体的分子结构式，另存为*.pdb格式文件。用PyMol软件剥离蛋白结构的水分子和原配体，另存为r.pdb格式文件。分别将“1.1”项得到的阿魏酸结构式原配体和靶点蛋白上传到Swiss Dock平台(http：//www.swissdock.ch/)进行分子模拟对接。

2 结果

2.1 阿魏酸的相关信息及靶点预测

检索台湾中医药资料库，得到阿魏酸的分子结构式(图2)。在Swiss Target Prediction数据库中检索阿魏酸得到 106个基因靶点，与Gene Card、Open Targets平台搜索得到的靶点基因进行比对，得到29个共同靶点基因，见图3。

图2 阿魏酸的分子结构式

图3 共同靶点的韦恩图

2.2 核心基因Hub的筛选

将29个共同靶点上传到STRING平台，得到蛋白互作PPI网络图(图4)。利用Cytoscape软件中的插件“MCODE”对网络进行分析，得到6个核心基因分别是STAT3、CASP3、MTOR、AR、MAPK1和ERBB2。见图5。

图4 PPI网络图

图5 Hub基因网络图

2.3 基因本体(GO)和京都基因百科全书KEGG信号通路富集

将共同靶点上传到David数据平台，进行GO和KEGG富集分析。生物过程(BP)包括62个条目，涉及细胞增殖调控、信号传导、调控RNA聚合酶III启动子转录、调控Stat3蛋白酪氨酸磷酸化和磷脂酰肌醇介导的信号传导等；细胞组成(CC)包括17个条目，涉及质膜、受体复合物、膜、钾通道复合物和细胞质核周区等；分子功能(MF)包括24个条目，涉及酶结合、相同蛋白质结合、转录因子结合、蛋白磷酸酶结合和G蛋白偶联腺苷受体活性等。按P-Value值进行排序，筛选排名前20列表(表1)、制图(图6)。

表1 基因本体GO数据(排名前20)

图6 GO富集分析结果气泡图

KEGG富集分析包含33条信号通路(P<0.05)，涉及缺氧诱导因子-1信号通路、Rap1 信号通路、鞘脂信号通路和叉头状转录因子信号通路等。按P-Value进行排序，选取排名前20列表(表2)、制图(图7)。

表2 KEGG富集分析(排名前20)

图7 KEGG通路基因富集结果气泡图

2.4 阿魏酸与心肌肥大主要靶点的分子对接

将6个Hub基因STAT3、CASP3、MTOR、AR、MAPK1和ERBB2分别上传到蛋白数据库RCSB，得到相对应的PDB蛋白，分别是4ZIA、3DEH、3LMG、4DRJ、5IR3和4O6E。将阿魏酸、原配体、靶蛋白分别上传到Siwss Dock平台进行分子模拟对接，结果用USCF Chimera软件查看。见表3。

对表3数据进行分析，阿魏酸与6个靶点的亲和力均<-5 kcal/mol(查阅相关文献报道分子结合的亲和力<5 kcal/mol，表明结合较紧密[8-9])，其中MAPK1、ERBB2、CASP3的亲和力最高，分别是-6.8、-6.4、-6.2 kcal/mol，它们分别与阿魏酸(红色表示)、原配体(蓝色表示)对接，见图8、图9和图10。

图8 阿魏酸与MAPK1

图9 阿魏酸与ERBB2

表3 阿魏酸与6个主要靶点的分子对接

图10 阿魏酸与CASP3

3 讨论

心肌肥厚又称心脏肥大，具有病理性特征，常见于高血压、房颤、心衰及心脏瓣膜疾病患者。产生的机理与自身供氧不足或血压过高有一定关联，心脏为了对抗长期压力负荷，或心肌力量不足，而产生一种代偿反应。心肌肥厚并不能增强原有心脏功能，相反易造成心脏弹性变差，舒张功能降低，心室腔减少，病情严重者甚至发生心衰和心律失常，威胁生命安全[10]。蔡珊珊等[11]将心衰阿魏酸组与心衰组进行比较，发现心衰阿魏酸组左心室内径减小，室壁肥厚程度降低，射血分数呈显著升高(P<0.05)，推测阿魏酸可能通过抑制小鼠心肌MMP9的表达，在一定程度上改善心脏功能。王一春等[12]通过研究阿魏酸对2型糖尿病小鼠心肌损伤的影响，发现阿魏酸组的小鼠体重、心脏质量和心肌质量指数，与模型组相比明显降低(均P<0.05)；模型组小鼠心肌细胞肿胀肥大，可见明显纤维增生，阿魏酸干预后心肌肿胀情况和纤维增生情况明显减轻，因此推断阿魏酸具有减轻2型糖尿病小鼠心脏损伤、心肌纤维化的作用。上述研究表明阿魏酸有调控心肌细胞、改善心功能的作用，但相关作用机制尚不明确。

本研究通过检索化合物、疾病靶点数据库，挖掘出29个阿魏酸调控心肌肥厚靶点。通过对靶点的蛋白互作PPI网络分析，挖掘出6个核心靶点，分别是STAT3、CASP3、MTOR、AR、MAPK1和ERBB2。STAT3、MTOR和MAPK1具有调控细胞生长、增殖作用；CASP3可控制细胞凋亡；AR为雄性激素受体，与雄性激素结合刺激蛋白质合成代谢，可促进氮沉积和增加肌纤维的数量和厚度等；ERBB2为表皮生长因子EGFR家族成员之一。将阿魏酸与6个核心靶点进行分子对接，结果亲和力均<-5 kcal/mol，其中MAPK1、ERBB2和CASP3结合得更加紧密，可能是阿魏酸作用的关键靶点。MAPK1又称丝裂原活化蛋白激酶-1，属于MAPK(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族成员。MAPK家族主要分为细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulatedd kinases，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)和p38 MAPK三类[13]。MAPK家族能诱导目标蛋白磷酸化，产生生理效应，参与调控各种细胞功能，如生长、分裂、繁殖、运动、应激和凋亡[14-16]。CASP3又名半胱天冬蛋白酶3(Caspase-3)，参与机体内的蛋白水解反应、细胞凋亡，并引导细胞凋亡。通常情况下，细胞凋亡是机体正常细胞在基因调控下的程序性死亡，然而当T细胞受到外界干扰，被异常活化，加快清除机体内衰老细胞，而Caspase-3在T细胞凋亡过程中起着至关重要的作用[17-18]。ERBB2属于表皮生长因子受体家族ERBB，主要由胞外结构域、跨膜结构域胞质酪氨酸酶结构域组成[19]，现阶段发现有四种亚型：ERBB1、ERBB2、ERBB3和ERBB4。常晓等[20]研究黄芪多糖介导NRG-1/ErbB信号通路对糖尿病心肌细胞凋亡的作用时，发现黄芪高剂量组和二甲双胍组的ERBB2表达较正常组显著增加，因此提出ERBB2可能与心肌细胞凋亡有关的假设。此外，相关文献报道NRG-1/ERBB信号通路在调控心肌细胞的结构、生长、增殖、凋亡，以及维持其内在性能完整性方面有不可替代的作用[21-23]。HEDHLI等[24]研究小鼠在超负荷压力作用下心肌功能变化时，发现小鼠左心室ERBB2和ERBB4的mRNA水平升高，但当心力衰竭时，ERBB2/ERBB4的mRNA和蛋白表达水平低于对照组，因此得出ERBB分子在心肌肥厚转变成心衰过程中起着重要作用的结论。

对共同靶点进行GO和KEGG富集分析，GO分析包含细胞增殖调控、转录、蛋白磷酸酶结合及酶结合等。KEGG富集的主要信号通路是缺氧诱导因子-1信号通路(HIF-1 signaling pathway，P<0.05)。细胞是组成人体结构的基本单位，细胞的生长、繁殖需要外界提供有氧环境，但当环境的供氧不足或低下，会导致细胞新陈代谢发生紊乱，为了应对缺氧环境，机体启动复杂的反应机制，缺氧诱导因子-1信号通路在其中发挥着重要作用。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是由120kD的HIF-1α亚单位和91～94kD的HIF-1β亚单位组成的异源二聚体[25]。相关报道显示，缺氧诱导因子-1信号通路与磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB(NF-κB)及细胞外信号调节激酶(ERK)有着密切联系[26]，而这些激酶参与了调控细胞增殖、生长和凋亡。

综上所述，阿魏酸可作用于多个靶点、信号通路来调控心肌肥厚，但其作用效果仍需要进一步深入研究。