植物提取物活性成分鉴定方法研究进展

方洛云 蒋林树

(北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206)

中华人民共和国农业农村部公告第1773号将中草药、药食同源植物中筛选的具有饲用可行性和显著的保健功效的115种天然植物列入《饲料原料目录》。在2019年颁布的《天然植物饲料原料通用要求》中明确了可饲用天然植物作为饲料原料或添加剂使用的加工方式和标准，促进了可饲用天然植物在饲料加工中的应用[1]。

植物提取物就是以天然植物为原料，经过物理和/或化学提取分离过程，定向获取和浓缩植物中的某一种或多种有效活性成分，而不改变其有效成分结构形成的产品[2]。饲用植物提取物具有天然、绿色、毒副作用小等优点，在饲料工业中日益受到重视。饲料营养活性物质是指饲料原料天然存在的或饲料中营养物质在饲料加工过程中及在动物体内消化代谢过程中产生的，具有诸如促进肠道健康、维持理想的免疫平衡和氧化平衡、调节基因表达等特殊营养调控或保健功能的超微量成分，根据化学分类方法可将其分为多酚类、寡糖类等[3-4]。由于饲用植物提取物中的活性成分对植物提取物发挥各项功能起到了重要作用。对这些活性成分进行定性、定量鉴定也成为动物营养研究的热点之一。

1 植物提取物活性成分主要鉴定方法

植物提取物是一个非常庞大的复杂体系，复杂性体现在植物提取物所含成分的种类多、含量差异大，不仅理化性质差异大，结构差异也大。而要有效利用植物提取物，就必须运用现代高新技术和各种化学、物理方法来定性、定量测定植物提取物中的活性成分。目前，测定植物提取物中活性成分的方法主要有光谱法、色谱法、质谱法及它们的联合应用技术等。

1.1 光谱法

1.1.1 紫外-可见分光光度法

紫外-可见分光光度法是在190～800 nm波长内测定样品的吸光度，用于定性、定量鉴定的方法。该方法灵敏度较高、操作方便。例如，紫外-可见分光光度法虽不能鉴定出柑橘提取物和沙棘提取物中各种黄酮的具体成分，但可以快速、简便地测定柑橘提取物和沙棘提取物中总黄酮含量。这是实验室用来测定植物提取物中总黄酮含量的快检手段之一[5]。

1.1.2 红外吸收光谱法

红外吸收光谱法主要是利用被测物质的分子对不同波长的红外辐射吸收程度不同而对物质进行分析的方法[2]。红外图谱能给出样品中所有化学成分的结构信息，在植物提取物活性成分测定方面有较好的应用前景。在植物提取物的鉴定中，红外光谱法常与其他理化方法联合使用，如红外光谱与液相色谱-质谱联用检测技术可对多酚类物质进行结构鉴定[6]。

1.1.3 核磁共振光谱法

核磁共振光谱法是将核磁共振现象应用于分子结构测定的一种技术。目前波普研究主要集中在H谱和C谱2类原子核的波谱，核磁共振波谱可以提供分子中化学官能团的数目和种类。核磁共振经常用于植物提取物中未知活性成分的结构鉴定，如通过液相将植物中某一未知成分纯化和提取，将获得的单体进行核磁共振，比对后可命名该化合物[7]。

1.2 色谱法

色谱法是通过利用植物提取物中的化学成分在固定相和流动相中的分离差异，利用这种差异使活性成分各组分分离，并根据分离所得到的色谱图进行植物提取物的鉴别[2]。色谱法能对植物提取物中活性成分进行定性和定量分析，是目前对植物提取物活性成分进行检测的最主要的方法。液相色谱与质谱、核磁共振等技术联合应用是对植物提取物活性成分进行深度分析的重要手段之一[8]。

1.2.1 薄层色谱法

薄层色谱法是将适宜的固定相涂布于薄板上形成一均匀薄层，根据样品的比移(Rf)值与对照品的色谱图的Rf值进行对比，用以对样品化学成分进行分离、鉴定的一种层析分离技术。薄层色谱法在植物提取物活性成分的定性和定量分析方面有着非常广泛的应用。例如，孙熙宁等[9]采用薄层色谱法测定了构树叶中的牡荆素和芹菜素；于姗姗等[10]采用薄层色谱法测定了槐枝中芦丁的含量。

1.2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法是以液体为流动相，将待测样品的溶剂、缓冲液等流动相泵入色谱柱，根据样品不同成分与固定相的相互作用差异，不同成分依次脱离色谱柱时得到不同的峰信号，通过分析比对峰信号实现对样品分析。高效液相色谱法可用于鉴定植物提取物中的多酚类、生物碱类、皂苷类、黄酮类等化合物以及多肽、多糖等生物大分子。

1.2.3 气相色谱法

气相色谱法以气体为流动相，利用待测样品的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。气相色谱法可用于测定植物提取物中的脂肪酸、有机酸、植物精油等，尤其是在对植物精油的鉴别中发挥着重要作用。

1.2.4 超临界流体色谱法

超临界流体色谱法是以超临界流体做流动相，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程。超临界流体色谱兼有气相色谱和液相色谱的特点，常以二氧化碳为流动相，在定性、定量方面有较大的优势，还可以用多种梯度技术来优化色谱条件。鉴于超临界流体更强的溶解性和更大的扩散系数，超临界流体色谱法可用于分析鉴定植物精油等。

1.3 色谱-质谱联用技术

色谱-质谱联用技术是将色谱法和质谱结合起来，通过色谱法将植物提取物中不同活性成分进行分离，对分离后的活性成分运用质谱法进行定性和定量检测。例如，利用液相色谱-质谱联用技术对黄酮类化合物进行分离、鉴定等，利用气相色谱-质谱联用技术对植物提取物中易挥发性物质如植物精油、脂肪酸等进行定性、定量测定等[11]。

1.4 其他方法

对植物提取物中的活性成分进行定性、定量分析的方法还有电化学分析法、毛细管电泳法、近红外光谱法、单晶衍射法以及多种技术联用等方法。

2 植物提取物中主要活性成分鉴定

2.1 多酚

多酚广泛存在于各种植物，由于其对人类和动物具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、调控脂质代谢等各项生理而引起科研工作者的广泛关注。多酚按照结构分为类黄酮和非类黄酮化合物(芪、酚酸和木酚素等)两大类，前者包括花色苷、黄酮醇和黄烷酮等，后者包括咖啡酸、阿魏酸、绿原酸等小分子酚酸以及白藜芦醇等[12]。薛宏坤等[13]用紫外-可见光谱扫描葡萄皮色素的粗提物样品溶液，发现在280、520、330 nm波长处均有吸收峰，说明样品中的主要活性成分为花色苷类，利用液相色谱-质谱联用对分离所得的花色苷类进行结构鉴定，得出3种糖苷。钟迪颖[14]通过傅里叶红外光谱分析仪和高效液相色谱串联质谱对紫花苜蓿花朵中的花色苷进行了鉴定，共得到13种花色苷单体，包含9种花色苷和4种花色苷衍生物。杨炜琪等[15]采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱串联质谱(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS/MS)在线快速分离鉴定降香中的黄酮类化学成分，鉴定出了27个主要色谱峰。伏建峰等[16]应用高效液相色谱对黄芩水提液进行分离纯化，对目标化合物采用质谱、核磁共振和红外光谱等技术进行结构解析，确证目标化合物为2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇。王映红等[17]采用高效液相色谱-质谱法与高效液相色谱-核磁共振氢谱法对土茯苓提取液中的二氢黄酮醇苷类成分进行分析鉴定，结果从土茯苓中鉴定出4个二氢黄酮醇苷异构体。瞿志杰等[18]采用半制备液相色谱与制备薄层色谱联用技术快速纯化玉竹中4种高异黄烷酮，通过核磁共振谱、质谱及紫外光谱进行结构鉴定，鉴定出了这4种黄烷酮化合物的结构。刘红兵等[19]利用液相-固相萃取-核磁共振/质谱联合应用技术成功鉴定出了牛至植物中的咖啡酸三聚体类化合物。陈燕飞等[20]采用薄层色谱法对冬葵子的化学成分进行了定性检测，从中分离鉴定出了阿魏酸。张国升等[21]采用气相色谱-质谱联用技术测定和鉴定了芦根中阿魏酸的含量和结构。潘明飞等[22]采用红外光谱、紫外光谱、质谱和核磁H谱、C谱对获得的金银花绿原酸进行了化学结构鉴定。闫仲丽等[23]采用质谱法定量分析了果浆保健品中白藜芦醇的含量。

在植物提取物研究领域，对多酚的测定基本是追随中草药的测定方法。随着测定技术的发展，对多酚的定性测定已从最初的紫外-可见光到指纹图谱，再到最新的DNA图谱；对多酚的定量测定也从植物提取物总量测定发展到了靶向或非靶向化合物的含量测定。

2.2 植物多糖

植物多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、调节肠道等多种生物功能，能够改善动物生长性能，提高机体免疫力，改善肠道健康。多糖的结构与功能存在着密切的关系，不同的分子结构和不同的分子质量都会影响到多糖的生物活性，因此十分有必要对多糖结构进行鉴定。李胜男等[24]采用凝胶渗透色谱法测定了肉桂的相对分子质量，采用柱前衍生高效液相色谱法测定了肉桂中性多糖的单糖组分，通过甲基化法和核磁共振法测定了其单糖的连接方式，结果发现，肉桂的主要单糖为葡萄糖，单糖有3种连接方式。朱静坚等[25]采用高效液相色谱法测定了白术单糖的衍生物，得到指纹图谱，通过白术多糖指纹图谱鉴别出了5个共有峰，分别为鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。王国明等[26]采用传统水提法、快速溶剂萃取(FSE)技术提取人参、西洋参多糖，通过气相色谱-质谱联用技术分析其中的单糖组成，结果表明，人参多糖及西洋参多糖均由阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖组成。

虽然目前采用液质联用、气质联用等技术对多糖进行检测已经相对成熟，但由于多糖高级结构的复杂性，对多糖的多维结构与功能之间的构-效关系的深入研究还略为不足，还需采用更多的检测技术如核磁共振等对多糖的高级结构进行鉴定。

2.3 植物精油

植物精油是从植物中提取和分离得到的具有芳香味的油状物质，其对动物具有多种生物调控作用。黄婷[11]采用气质联用技术分析了4种樟属植物精油的40余种化学成分。李敏等[27]采用超临界二氧化碳萃取技术对巨鹿金银花精油进行了提取，并采用气质联用技术鉴别出了金银花精油成分。Santerre等[28]比较了经典气相色谱技术和超临界流体色谱技术对柠檬精油定性、定量结果的差异，获得了相类似的结果。Li等[29]采用气质联用技术对山苍子精油的化学成分进行了鉴定和定量分析，含量最高的3种化学成分分别为反式柠檬醛、顺式柠檬醛和d-柠檬烯。Sonmezdag等[30]通过气质联用技术对开心果油中的挥发性成分进行了测定，各物质检出浓度为0.07～2.26 mg/kg，检出限和定量限均能满足检测要求。Napolitano等[31]通过液质联用技术对榛子中的油脂类进行了测定，约82种油脂被检测出，某些油脂是第1次被检出。

植物精油具有部分替抗、减抗的功能，因而引起了饲料行业的极大关注。目前已有产品投入市场，针对植物精油的定性、定量研究工作也成为精油产品品控的关键。目前国内外对植物精油的检测方式多以气相色谱法检测为主。饲用植物精油的检测多脱胎于医药行业、化妆品行业的检测方法，对饲用植物精油本身所特有的一些特征组分研究甚少，这将是今后饲用植物精油基础研究的重要部分。

2.4 有机酸

有机酸包括有柠檬酸、乳酸、抗坏血酸、绿原酸等，植物中的有机酸一般都与钾、钠、钙等结合成盐，有些与生物碱结合成盐。目前对植物提取物中有机酸的检测相对成熟，以高效液相色谱法最为常用。陈松辉等[32]建立了通过离子色谱法来测定饲料添加剂中甲酸、乳酸、柠檬酸的检测方法。许金华等[33]采用高效液相色谱法测定了五味子中柠檬酸的含量，结果显示4种五味子中柠檬酸的平均含量分别为172.8、127.1、126.5和117.9 mg/g。王彦平等[34]建立了应用高效液相色谱法同时测定青贮饲料桑中乳酸、乙酸和丙酸含量的方法，测定结果显示乳酸、乙酸和丙酸在一定浓度下具有良好的线性关系，3种物质检出限为4.928～9.489 mg/L，该方法适用于青贮饲料桑中有机酸的定量检测。

2.5 生物碱

生物碱是一类含氮碱性有机物，是某些饲用植物提取物中的有效成分。阿不力米提等[35]以白喉乌头不同部位为试验材料，采用无水乙醇超声波法提取乌头碱，利用分光光度计于231 nm波长条件下测定吸光度，计算总生物碱的含量，结果表明，乌头碱在0.000 4～0.002 0 mg/L浓度内线性关系良好。代珊等[36]通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定不同附子炮制品中乌头碱、新乌头碱等14种生物碱的含量，采用化学计量学分析不同附子炮制品的差异，结果表明，各生物碱在各自浓度范围内线性关系良好。钱茂升等[37]结合柱色谱法和紫外分光光度法，以盐酸小檗碱为对照品，黄连下脚料为供试品，在波长229 nm处测定黄连下脚料中生物碱的吸光度，依据盐酸小檗碱对照品吸光度与浓度之间的定量关系，计算出了黄连下脚料中生物碱的含量。王昊天等[38]应用高效液相色谱法对31批不同产地的苦参所含的4种生物碱(槐定碱、苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱)的含量进行了测定，并建立了指纹图谱。目前，对植物提取物中生物碱的鉴定方法主要包括色谱法[39]、紫外分光光度计法[40]、电泳法[41]等，这些方法为植物提取物中生物碱的定性、定量检测提供了技术保障。

3 小结与展望

随着我国禁抗时代的到来，饲料工业对植物提取物的需求进一步扩大，植物提取物中活性成分的种类和含量检测成为植物提取物生产与品控的关键，也成为植物提取物产业可持续发展的重要前提。

随着现代检测技术不断更新换代，为饲用植物提取物活性成分的定性、定量检测提供了强有力的技术支撑，使其取得了较大进展，但也存在以下不足：第一，由于饲用植物提取物研究脱胎于中草药提取物，因此，它的检测标准和检测数据库非常依赖于中草药活性成分研究进度。对某些不具有医用价值的植物提取物，由于中医药标准品数据库中无相应的标准品，就导致对某些饲用植物提取物的测定束手无策，因此，对某些特定的使用广泛的饲用植物提取物还需要加大基础研究力度。第二，由于植物提取物具有多组分、多靶点的复杂体系，科研工作者对天然植物中的生物活性成分虽然已有所了解，但对其研究不多，对不同组分之间相互作用机制更缺少研究。第三，植物提取物中的活性成分可列为饲料营养成分组成，也可作为饲料配方的重要参考，但还需开展更多的基础研究工作。

总之，持续开展植物提取物活性成分这一领域的研究将为传统饲料科学整体现代化发展开辟出新方向和新领域。