N6-甲基腺嘌呤RNA甲基化在动物营养生理与代谢中的表观转录调控作用

钟 翔 王 欢 王 恬

(南京农业大学动物科技学院，南京 210095)

近年来，表观转录组学开启了生命科学领域的全新方向，其主要研究RNA化学修饰对基因表达的重要调控功能，这些动态、可逆的RNA化学修饰对动植物的表型和性状具有重要的调控作用。解析表观转录组对动物表型和性状的影响，揭示其规律和特征，发展新的动物营养理论体系，开发新的营养调控技术，有望为未来畜牧业的发展带来新的革命。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是表观转录组学的主要研究内容之一，近年从原核细菌到真核生物和人类的研究已取得了巨大突破。m6A RNA甲基化作为一种动态、可逆的新型表观转录修饰，广泛存在于植物和哺乳动物中，是mRNA上最丰富的内部修饰[1]。m6A RNA修饰可在转录后调控RNA剪接、翻译、稳定性及转移，甚至RNA高级结构等，从而调节下游信号通路和基因的表达，进而影响干细胞分化[2]、免疫反应、精子发生[3]和肌肉发育[4]等多种生物学过程。

m6A RNA甲基化修饰在营养生理和代谢中发挥着重要作用，如控制昼夜节律[5]、调控脂质积累[6]和脂肪生成[7-8]、调节离子代谢[9]以及介导宿主与微生物互作等[10]。m6A修饰异常会导致细胞基因表达和功能失调，进而导致细胞分化异常和稳态失衡，最终引发炎症反应、代谢性疾病，甚至癌症的发生[11]。因此，近年来m6A RNA甲基化对机体营养生理与代谢的影响已成为研究的热点。本文从m6A RNA甲基化的分子基础，以及其与糖代谢、脂质代谢、离子代谢和微生物之间的相互作用进行综述，为揭示m6A RNA甲基化修饰在畜禽营养生理与代谢方面的调控机制提供理论支撑，并为未来畜牧业的发展提供新的思路，也为靶向药物开发、疾病预防与治疗提供参考。

1 m6A RNA甲基化的分子基础

RNA上存在150多种化学修饰，其中m6A RNA甲基化是真核生物mRNA内部最丰富的一种化学修饰。1974年，Desrosiers等[12]首次发现m6A修饰，其主要富集在终止密码子和3′-非翻译区(UTR)附近。m6A位于共有基序RRACH[R=鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)，H=腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，A=m6A]上，受到甲基转移酶和去甲基化酶的可逆动态调控，在转录和转录后水平调控基因表达。在真核生物中，m6A修饰能够调控RNA的稳定、剪接和翻译等生物学过程。

m6A RNA甲基化是一种可逆的动态化学修饰，由甲基转移酶复合物催化形成，被去甲基化酶去除。催化m6A形成的甲基转移酶复合物，也被称为“Writers”，主要由甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(METTL14)、Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)和其他组分如病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白(VIRMA)和RNA结合基序蛋白15(RBM15)组成，能以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基化供体催化RNA上特异位点的腺嘌呤甲基化为m6A。METTL3是甲基转移酶复合物中最重要的组成部分，负责催化SAM中的甲基基团转移到腺嘌呤碱基，产生S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)[13]。METTL14负责稳定甲基转移酶复合物的结构，并识别特定的RNA序列作为催化底物[13]。METTL14与METTL3同源，但其缺少酶的催化活性结构域，因此METTL14被认为是通过提供RNA结合的稳定性来提高METTL3的催化活性。在催化过程中，METTL3和METTL14形成稳定的1∶1异源二聚体，发挥协同作用[14]。

m6A去甲基化酶，也被称为“Erasers”，包括脂肪和肥胖相关蛋白(FTO)和AlkB同系物5(ALKBH5)[3,15]。两者主要在细胞核中表达，且均以二价铁离子(Fe2+)/α-酮戊二酸依赖方式催化m6A去甲基，但过程不同。FTO是第1个被发现的m6A去甲基化酶，标志着m6A修饰是动态可逆的。FTO首先氧化m6A生成N6-羟甲基腺苷(hm6A)，随后氧化hm6A生成N6-甲酰腺苷(f6A)，最后催化f6A生成腺嘌呤，完成去甲基化过程[16]。ALKBH5是第2个被发现的m6A去甲基化酶，可以直接催化m6A生成腺嘌呤，不产生任何中间产物[17]。大量研究表明，FTO主要调控动物肥胖与代谢，而ALKBH5则参与动物精子发生等生命过程[3,7]。

m6A可以通过募集阅读蛋白(Readers)直接影响RNA加工。m6A RNA阅读蛋白主要由YT521-B同源性(YTH)蛋白家族组成，包括位于细胞核的YTHDC1，以及位于细胞质的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3和YTHDC2。通过识别和结合m6A位点，阅读蛋白可以促进RNA的剪接、衰变和翻译。最近的研究发现了核异质核糖核蛋白(HNRNP)家族和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BP)家族等多种新的m6A阅读蛋白[18-19]，进一步丰富了m6A的理论体系。

2 m6A和营养代谢

m6A是真核生物mRNA上最普遍的甲基化修饰，参与调节多种生物学过程。m6A RNA修饰的失衡可导致多种疾病的发展，例如肥胖[20]、糖尿病[21]、代谢综合征[5]和癌症[22]。此外，营养水平和代谢模式的转变也可影响机体m6A RNA甲基化修饰，表明两者之间具有密切的相互作用。

2.1 m6A RNA甲基化调控糖代谢

METTL3作为m6A甲基转移酶广泛参与细胞糖代谢，尤其是在肿瘤代谢中。研究表明，METTL3通过其m6A甲基转移酶活性以m6A阅读蛋白IGF2BP2或IGF2BP2/3依赖性的方式调控己糖激酶2(HK2)和葡萄糖转运载体1(GLUT1)的mRNA水平和稳定性，进而活化糖酵解途径，最终促进大肠癌的发展[22]。此外，通过敲除METTL3降低机体m6A水平可以抑制肿瘤细胞的葡萄糖摄入、乳酸产生速率和ATP生成。进一步研究表明，YTHDF1/真核延伸因子2(eEF2)复合物和IGF2BP3可识别含有m6A修饰的丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)mRNA，促进PDK4 mRNA的稳定性和翻译延伸，从而调节肿瘤细胞的糖代谢[23]。

FTO作为一种重要的m6A去甲基化酶可调控能量和脂质代谢稳态。首先，FTO可通过依赖于m6A介导的基因表达调控肝脏糖异生，从而影响糖代谢过程。目前证实，FTO表达异常与Ⅱ型糖尿病有关，并导致m6A RNA甲基化修饰水平降低[24]。此外，FTO诱导的叉头框蛋白O1(FOXO1)、葡萄糖-6-磷酸(G6P)和二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT2)的表达与人类患者血清葡萄糖水平升高具有相关性[21]。研究发现，小鼠肝脏中敲低FTO可上调FOXO1 mRNA上的m6A丰度[24]，从而影响脂肪组织热量的生成。此外，FTO可以正向调节激活G6P的转录因子4(ATF4)，促进葡萄糖的产生[25]。肝脏特异性过表达FTO可降低mRNA 5′-UTR区域m6A修饰水平，并促进ATF4 mRNA翻译[26]，表明FTO相关代谢表型与ATF4失调有关。其次，FTO也可以通过非m6A依赖的方式调节糖代谢。研究表明，FTO单核苷酸多态性影响肥胖易感性和代谢，其机制可能是通过控制增强子来改变邻近基因的表达[27]。此外，过表达FTO可以降低瘦素诱导的脂肪细胞信号转导和转录激活因子3(STAT3)的磷酸化，从而使得G6P表达失调[28]。提高FTO的表达也会提高环磷酸腺苷(cAMP)响应元件结合蛋白1(CREB1)和CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP‐β)的表达，从而调控肝脏糖异生基因的表达[29]。

2.2 m6A RNA甲基化调控脂质代谢

m6A RNA甲基化对脂质稳态具有重要的调控作用。研究发现，高水平的FTO促进小鼠脂肪沉积，从而导致肥胖率的增加。反之，FTO基因敲除则可显著抑制脂肪的过度积累和肥胖的发生[20]。FTO主要通过m6A RNA甲基化修饰过程促进细胞内脂质沉积。有研究发现，FTO通过降低m6A RNA甲基化修饰促进甘油三酯异常积累，而FTO突变体对甘油三酯含量则无显著改变[7]，这表明FTO可通过调节m6A RNA甲基化修饰参与脂肪细胞脂代谢调控过程。3T3-L1前脂肪细胞中敲低FTO可通过上调细胞周期蛋白A2(CCNA2)和周期蛋白依赖性蛋白激酶2(CDK2)mRNA上的m6A水平，以YTHDF2依赖的方式促进CCNA2和CDK2 mRNA降解，阻滞细胞周期，从而抑制脂肪积累[8]。以上研究表明，FTO可通过m6A-YTHDF2依赖性途径调控细胞周期，从而参与脂代谢过程。另外，YTHDC2在肥胖小鼠和非酒精性脂肪肝患者中的表达显著降低，提示其可调控脂质形成[30]。在机制上，敲低YTHDC2可增加固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)等mRNA的稳定性，促进这些成脂基因的表达，导致肝细胞中甘油三酯的过量积累[30]。近年，关于m6A调控畜禽脂质代谢的研究也陆续有报到。Jiang等[31]通过对长白猪和金华猪的背最长肌进行m6A测序，并揭示了线粒体载体同源蛋白2(MTCH2)通过m6A-YTHDF1依赖的方式促进肌内前脂肪细胞的脂肪生成。Cheng等[32]利用甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序(MeRIP-Seq)技术绘制了高脂系肉鸡和低脂系肉鸡脂肪组织中的m6A修饰图谱，发现很多具有m6A修饰的差异基因与脂肪酸生物合成和代谢有关。Feng等[33]研究发现，喂高能量低蛋白质饲粮的蛋鸡肝脏中FTO和脂肪生成基因表达水平显著升高，这可能是导致蛋鸡肝脏脂肪沉积的重要原因。这些研究发现将为提高动物生产效率、靶向调控畜禽肉品质、甚至基因育种提供重要的思路。

综上所述，FTO可以通过依赖于或非依赖于m6A的方式影响碳水化合物和脂质代谢。然而，FTO通过m6A在什么条件下、以何种方式、通过何种机制精准地调控碳水化合物和脂质代谢仍未清楚。外界刺激或胞内信号分子均可影响m6A的表达模式[5]，这意味着相关信使分子的缺失可能抑制其下游代谢功能的激活。由此推测，FTO在正常生理条件下可通过非依赖于m6A的方式调控机体代谢，但在机体遭受生理性应激或者疾病条件下，FTO倾向于依赖m6A的方式发挥生物学作用。

2.3 m6A RNA甲基化调控铁离子代谢

铁是动物机体不可或缺的微量元素，在DNA和RNA的生物合成和修复、氧气运输、能量生成、信号转导以及免疫防御等生物学过程中发挥着重要作用。m6A RNA甲基化与铁离子关系密切。去甲基化酶FTO和ALKBH5发挥去甲基化作用时需要二价铁离子的催化。甲基转移酶中的铁离子可以裂解SAM，并为合成活性物质提供甲基[34]。甲基化酶METTL14能够上调长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1OT1)的m6A水平，RNA结合蛋白IGF2BP1识别KCNQ1OT1并提高其稳定性，进而上调铁吸收蛋白——转铁蛋白受体(TFRC)的基因表达量，促进细胞吸收铁[7]。ALKBH5通过下调F-Box和富含亮氨酸重复蛋白5(FBXL5)m6A水平，提高其RNA稳定性，从而上调基因表达水平[35]。FBXL5的上调导致铁调控蛋白2(IRP2)的泛素化，从而促进IRP2的降解，进而保护细胞免受铁超载带来的不良影响[35]。YTHDF1能够促进m6A修饰的TFRC的表达，促进机体对铁的吸收，调控肿瘤发生和肿瘤细胞的增殖[36]。以上研究表明，m6A修饰在铁离子代谢中扮演重要角色，提示我们今后可以从m6A角度调控动物机体铁代谢，以改善铁失衡对动物造成的不良影响。

2.4 营养代谢影响m6A RNA甲基化

机体营养水平、营养元素和饲粮模式可影响m6A RNA甲基化修饰，从而改变基因表达。在小鼠的研究中发现，母体高脂饲粮可显著提高甲基化转移酶METTL3的表达而下调去甲基化酶FTO的水平，从而显著增加3周龄子代小鼠内脏脂肪中的m6A RNA甲基化修饰[37]。然而，饲喂高脂肪饲粮的大鼠下丘脑中FTO的表达显著增加，导致肥胖[38]。同样有研究指出，高脂饲粮饲喂的小鼠脂肪组织中FTO表达上升，而总的RNA m6A水平显著降低[39]。以上结果证实，高脂饲粮模式对不同的动物和不同的组织器官中m6A RNA甲基化的影响存在差异。Gebeyew等[40]研究发现，低蛋白饲粮中添加瘤胃保护性蛋氨酸和赖氨酸可显著提高羔羊肝脏和肌肉的m6A丰度，降低FTO和ALKBH5的表达水平。甜菜碱是一种甲基供体，能为SAM的合成提供不稳定的甲基，并下调高脂饲喂小鼠脂肪组织中FTO基因和蛋白的表达，增加m6A RNA甲基化修饰水平，从而改善线粒体功能，缓解代谢紊乱[39]。相反，环亮氨酸作为蛋氨酸腺苷转移酶抑制剂，通过降低SAM水平抑制甲基化。体外试验研究发现，环亮氨酸可降低了人肝脏细胞(HepG2)的m6A RNA甲基化水平，从而改变线粒体融合相关基因的表达[6]。近年来，从姜黄素和绿茶中提取的膳食多酚可能通过调节表观转录的组成元件发挥生物活性。姜黄素已被证明可以诱导表观转录组的变化[41]。饲粮中添加姜黄素在mRNA水平上提高了仔猪肝脏中METTL3和METTL14表达，降低了ALKBH5表达，增强了m6A修饰[42]。同样，在小鼠的研究中，姜黄素可通过降低ALKBH5表达，提高m6A水平，进而抑制脂肪沉积[43]。姜黄素调控m6A RNA甲基化的机制尚不清楚，有研究认为姜黄素的这些作用可能与微小RNA(microRNA)有关。研究表明，姜黄素可改变microRNA在体内和体外的表达[44]，而m6A修饰过程中METTL3与mRNA底物结合受到microRNA调控[45]。总之，营养代谢在m6A调控中发挥着重要作用，但许多潜在的机制仍未被解析，需要进一步的研究。

3 m6A与微生物群

宿主黏膜表面被数千种微生物群落定植，其中大部分是细菌，它们在对营养物质吸收方面发挥着重要作用。肠道菌群作为一种特定的共生体已被证实能调控宿主的m6A RNA修饰谱，而宿主m6A修饰同样也会影响肠道菌群。因此，m6A可能作为一种重要的“信使分子”参与宿主和微生物群之间的交流互作。Wang等[10]使用液相色谱/质谱和m6A-Seq揭示了无菌小鼠和正常小鼠的总m6A/A比率和不同组织中m6A转录组的模式与分布，发现无菌和正常小鼠的肠道、肝脏和大脑中的m6A水平具有显著差异；同时，无菌小鼠大脑的m6A模式更类似于胚胎小鼠，这表明出生后m6A修饰会随着微生物暴露而迅速改变。Zong等[46]报道了产肠毒素大肠杆菌感染后，猪肠上皮细胞可通过增加METTL3的表达量提高m6A的丰度，促进β防御素的产生。然而，肠道菌群调控宿主m6A RNA甲基化的具体分子机制仍不清楚。近期的研究表明，肠道菌群可能通过代谢产物影响机体的m6A RNA甲基化修饰[47]。真核细胞中SAM和α-酮戊二酸的含量会直接影响细胞内的m6A修饰。肠道菌群可以通过叶酸、甜菜碱、胆碱、维生素B12、富马酸、琥珀酸和丁酸等微生物代谢产物来调节一碳循环、蛋氨酸循环和三羧酸循环(TCA)，从而调控SAM和α-酮戊二酸的产量，导致m6A修饰发生改变[47]。研究表明，甜菜碱和环亮氨酸作为甲基供体和甲基化抑制剂能够调节猪脂肪细胞、小鼠和斑马鱼的m6A修饰[7,48]。维生素B12在合成SAM的过程中发挥着重要作用，Mosca等[49]研究发现维生素B12缺乏会引起SAM和神经功能相关的mRNA m6A水平降低，从而导致小鼠神经功能异常。丁酸是细菌产生的一种短链脂肪酸，能够进入TCA，使α-酮戊二酸水平升高，最终下调结直肠癌细胞中m6A水平和METTL3的表达[50]。不仅如此，肠道菌群产生的次级胆汁酸也可以诱导表观遗传修饰。脱氧胆酸通过与METTL3结合破坏METTL3-METTL14-WTAP复合体，从而调控胆囊癌的发展[51]。

肠道微生物能够调控宿主基因表达，同时宿主遗传变异反过来也会影响机体肠道微生物群组成，这表明宿主和肠道微生物群之间存在通信分子。已有研究表明，肠道微生物群能通过诱导染色质重塑、组蛋白修饰和非编码RNA变化来调节宿主基因的表达[47]。最近的研究发现，m6A RNA修饰可以影响非编码RNA，如microRNA、环状RNA(circRNA)和lncRNA的代谢，并参与染色质重塑和组蛋白修饰[52]。因此，m6A可能作为一个“信使”分子，通过介导非编码RNA、染色质重塑和组蛋白修饰参与宿主和微生物群之间的相互作用。

4 小 结

动态和可逆性的m6A RNA甲基化通过调控基因表达对机体营养生理与代谢的稳态发挥关键作用，反之，营养物质、营养水平和饲粮组成可改变m6A RNA甲基化修饰来影响动物的生长发育和性状的形成等。为了深入理解动物营养生理和代谢过程，构建动物精准营养模型，实现高效优质和降本增效的养殖模式，将来需要对以下问题进一步探讨：1)揭示m6A RNA甲基化调控畜禽营养消化、吸收和代谢的分子网络机制，明确其规律和特征，为实现不同动物、不同品种和不同阶段的精准营养调控提供靶点；2)建立基于m6A RNA甲基化精准营养调控的饲粮模式；3)畜禽肠道微生物与m6A RNA甲基化的相互作用有待进一步研究。