反刍动物瘤胃营养生理研究进展

刘军花 张 凯 毛胜勇 朱伟云

(国家动物消化道营养国际联合研究中心，江苏省消化道营养与动物健康重点实验室，南京农业大学动物科技学院消化道微生物实验室，南京 210095)

2014年，南京农业大学消化道微生物研究室主任朱伟云教授首次提出动物消化道营养的概念，并以此理论为核心组建江苏省消化道营养与动物健康重点实验室，2016年获批动物消化道营养国际联合研究中心。实验室立足畜牧业，围绕动物消化道营养这个核心问题开展消化道微生物与营养、营养代谢与动物健康、营养与畜产品品质及饲料营养与家畜绿色生产等方面的研究工作。

1 反刍动物瘤胃稳态的建立与维持

瘤胃是反刍动物消化道营养的源头，其发育状态对反刍动物高效、健康及绿色生产起重要决定作用。作为一个高效有序的连续“发酵罐”，瘤胃内栖息着大量复杂且多样的微生物群体，通过相互协作发酵植物性饲料并转化成挥发性脂肪酸(VFA)、菌体蛋白(MCP)及维生素等。瘤胃发酵产生的代谢产物除调控瘤胃壁形态功能发育以外，同时也是后段消化道重要的营养来源，对于维持反刍动物的正常生理功能和高效生产至关重要。瘤胃微生物与宿主在长期进化过程中形成紧密连接的共生关系。瘤胃微生物为宿主提供植物纤维降解所需的酶以及MCP和维生素，宿主为微生物的生长和生存提供有利的环境和生态位。瘤胃稳态的建立和维持是保证动物健康的必要条件，否则易导致一系列营养代谢疾病的发生，给反刍动物生产带来巨大损失。

1.1 瘤胃微生物区系的建立

瘤胃微生物区系的组成和功能影响宿主代谢、胃肠道发育和免疫功能建立。研究表明，纤维素分解菌、真菌和古菌(即产甲烷菌)在瘤胃中首先定植[1-2]。犊牛出生后20 min瘤胃中就可以检测出产甲烷菌和纤维分解细菌[3]。瘤胃中最后建立的是原虫，在21日龄时才在瘤胃中发现，其中利用淀粉的内毛虫属最先出现[4]。新生反刍动物瘤胃中早期定植的微生物主要来源于母畜的产道、粪便、皮肤和唾液[5]。尽管幼龄反刍动物存在食管沟反射，但是少量泄漏致瘤胃中的母乳仍然影响瘤胃微生物的定植，说明初乳不仅通过抗菌蛋白、免疫球蛋白、细胞因子和生长因子影响新生反刍动物的生长和免疫功能，而且影响瘤胃微生物的定植[6]。2月龄前瘤胃菌群处于强烈的波动期，到6月龄时趋于稳定，菌群组成也更加多样化，有利于适应饲粮的变化。随着反刍动物日龄增加，瘤胃中好氧和兼性厌氧菌的相对丰度逐渐降低，而普雷沃氏菌和瘤胃球菌等专性厌氧菌的相对丰度增加[7]。虽然瘤胃微生物组成随宿主的日龄而变化，但生长过程中饲粮的变化也是影响瘤胃微生物定植的重要因素，导致瘤胃微生物的变化更多的是日龄和饲粮的组合效果。尽管瘤胃微生物在出生时就快速定植，但是并不能行使完善的发酵功能，直到摄入固体饲料后才会逐渐形成完善的发酵功能，说明瘤胃早期微生物的定植只是为瘤胃功能的建立提供了潜在基础。此外，研究表明，早期瘤胃微生物调控的影响性持续到反刍动物成年后期[8-10]，这为在幼龄期通过操纵瘤胃微生物调控成年动物生理状态以及生长性能提供了可能性。

1.2 瘤胃壁形态和功能发育

瘤胃是反刍动物独有的消化吸收代谢器官，同时起着重要的屏障及免疫作用。瘤胃壁由内向外分为上皮层、固有层、肌层和浆膜层，不同细胞层行使着不同的生理功能，其中上皮层的营养物质吸收和代谢功能以及肌层的蠕动功能与反刍动物生产性能最为密切[11]。瘤胃上皮属于鳞状复层上皮结构，由角质层、颗粒层、棘突层和基底层组成，每层细胞的形态和功能不同，并且其发育受内源自发性和外源驱动性因素的调节，其中内源自发性因素主要包含遗传因素和日龄，外源驱动性因素主要包括饲粮和环境[12]。以往对于瘤胃上皮细胞层的划分依赖于光学显微镜下的细胞形态。近年来，随着单细胞测序技术在瘤胃组织上的应用，一种基于细胞基因表达相似性的分类方法应运而生。此种分类方法对每种细胞层进行了更为详细的划分，并定义了不同细胞层的标志性基因。有学者根据不同的标志基因，把基底层细胞划分为具有增殖能力的基底层细胞和普通基底层细胞，其中，角蛋白(keratin，KRT)14、KRT15和增殖标志蛋白Ki-67(proliferation marker protein Ki-67，MKI67)是具有增殖能力的基底层细胞的标志基因，KRT14和KRT15是普通基底层细胞的标志基因。另外，把双亮氨酸拉链激酶2(dual leucine zipper-bearing kinase 2，DLK2)作为颗粒层细胞的标志基因，把KRT10、S100钙结合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8，S100A8)和KRT6A作为棘突层细胞的标志基因。作者还发现了一种新型的通道间隙样棘突层细胞类型，将缝隙连接蛋白1(gap junction protein alpha1，GJA1)作为此种细胞类型的标志基因[13]。Yuan等[14]采集了妊娠30、60、90、110、130 d以及刚出生和出生后45 d等7个阶段的瘤胃组织，基于56 000个单细胞转录组数据，共鉴定出8种主要细胞类型，揭示了瘤胃上皮乳头和角质化发生发育的细胞和分子特征及其动态变化规律和异质性：基底细胞、角质细胞、分化角质细胞、终末分化角质细胞和特殊棘状层细胞是瘤胃上皮的细胞基础；在妊娠90 d，羔羊瘤胃上皮已经形成明显的微乳头和角质化特征，发现了2个重要的角质化过程，T-box 3转录因子(TBX3)是乳头发生的潜在标记基因；出生应激导致免疫细胞显著富集；出生后45 d伴随固体饲料介入导致棘突层细胞的富集，使得VFA代谢功能逐渐建立完善。然而，单细胞测序在瘤胃组织细胞分群的研究中也存在局限性。首先，单细胞测序的细胞活性要达到80%以上，直接导致角质层细胞的信息丢失。其次，细胞悬液的制备方法影响细胞的活性，间接导致部分细胞信息被忽略。当然，随着技术方法的不断完善，越来越多的瘤胃上皮细胞类型会被发现，但通过恰当的试验方法来验证测序结果的可靠性更为重要。

1.3 瘤胃微生物-宿主互作

胃肠道微生物-宿主互作影响宿主代谢及健康，在人类营养层面已经进行了广泛的研究。随着对反刍动物瘤胃营养生理领域的快速发展，瘤胃微生物组成、功能及代谢变化对宿主动物发育及健康的影响受到越来越多的关注[15-18]。Lin等[17]通过多组学联合分析发现，羔羊早期补饲开食料可以增加瘤胃中巨球型菌属(Megasphaera)、夏普氏菌属(Sharpea)和光岗菌属(Mitsuokella)的相对丰度，提高了属于α-淀粉酶的糖苷水解酶家族基因13(glycoside hydrolase family 13，GH13)的相对丰度，促进了瘤胃微生物对淀粉的降解，生成的VFA可能通过上调细胞生长相关基因的表达和下调促凋亡基因的表达，调控了瘤胃上皮的发育。最近的一项研究指出，早期补饲苜蓿干草或精料可以上调牦牛犊瘤胃丁酸产生菌属的相对丰度，改变了瘤胃上皮磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)基因表达，促进了瘤胃上皮发育[19]。但其忽略了补饲精料开食料或干草对瘤胃壁发育的差异化影响，以及造成瘤胃壁发育差异化的微生物-宿主互作机制。随着微生物研究技术的进步，研究发现饲粮不但造成瘤胃微生物组成和功能发生改变，同样影响瘤胃微生物的代谢功能和互作模式[20]。

瘤胃微生物和宿主之间具有密切的互作关系，宿主的发育及健康受瘤胃微生物组成及代谢的影响，同时瘤胃微生物区系的组成和功能也随宿主年龄和发育状态的变化而波动[7]。人和小鼠上的研究已证实胃肠道微生物与宿主遗传特性之间存在关系，这种关系在反刍动物中也被报道[21]。由于宿主年龄、发育阶段、饲粮和环境因素相互混杂，很难确定宿主遗传与胃肠道微生物之间的确切关系[22]。随着微生物研究技术的发展，宏基因组技术的应用加深了对宿主表型与微生物基因组关系的认识。Paz等[23]研究发现，瘤胃微生物群落的变化与荷斯坦奶牛和泽西奶牛的品种差异有关。Roehe等[24]证明了宿主遗传对瘤胃微生物代谢具有影响，尤其是对甲烷(CH4)产生相关的微生物的代谢活动。Gonzalez-Recio等[25]报道瘤胃微生物的相对丰度与宿主遗传背景[包括品种和单核苷酸多态性(SNP)基因型]之间存在密切关联。在最近的研究中，Li等[26]基于709头肉牛瘤胃微生物的研究发现，瘤胃微生物多样性指数、微生物类群相对丰度以及细菌总数量受到宿主加性遗传的影响。此外，在奶牛瘤胃内容物移植的研究中发现，移植大部分瘤胃内容物24 h后，瘤胃pH和VFA浓度恢复到瘤胃内容物移植前的水平。同时，与瘤胃内容物供体牛相比，移植后受体牛瘤胃菌群与交换前组成更为相似[27]。Li等[28]研究指出，梅花鹿与麋鹿杂交后代的瘤胃微生物群与任一亲本物种都不相同。总之，以上研究为宿主遗传与瘤胃微生物的关联提供了强有力的证据。但是，反刍动物瘤胃发育和生理功能如何影响微生物定植和功能的分子机制尚不清楚。

2 瘤胃营养生理与反刍动物高效健康生产

2.1 瘤胃营养生理与反刍动物高效生产

高效生产是能量高效摄取和高效利用之间的复杂平衡，涉及营养物质高效转化利用，减少甲烷排放导致的能量浪费及疾病状态下免疫激活导致的能量浪费等。反刍动物高效性状的形成可能是动物多器官协同作用的结果，瘤胃作为反刍动物最重要的消化吸收器官，是影响反刍动物饲料转化效率的关键器官[29]。瘤胃对营养物质转化利用效率主要决定于瘤胃微生物对营养物质的消化代谢效率和瘤胃组织对营养物质的吸收代谢效率[30]。有研究表明，高效肉牛/肉羊具有特定的瘤胃内容物微生物结构及功能[31]，并且与肉牛高效密切相关的特定微生物一定程度上可垂直遗传[26]。本实验室研究团队对370个反刍动物胃肠道样品进行了宏基因组测序，组装了超过10 000个非冗余的微生物基因组，共鉴定到了6 032 484个碳水化合物酶基因，包括了375个酶基因家族，此外在8 745个未培养的微生物基因组中共鉴定到了12 578个多糖降解位点，这些发现进一步提升了对反刍动物胃肠道微生物功能的认识。利用最新获得的微生物数据资源，重新分析了关于反刍动物饲料效率的数据，发现在基因组水平上，阿扎夏普氏菌(Sharpeaazabuensis)在高饲料效率组中有5～11倍的富集，含有GH13、碳水结合模块26(CBM26)和锚定结构(dockerin)等淀粉小体基因的瘤胃球菌属(Ruminococcus)在高饲料效率组中也有大量的富集，这些微生物的富集可能通过优化瘤胃发酵提高了能量利用效率[32]。最近的研究报道了不同饲料转化率奶牛瘤胃微生物的组成、功能和VFA产生途径存在差异[33-34]，其中，代谢乳酸产生丁酸的埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)在高饲料转化率奶牛瘤胃中的相对丰度较高；而产甲烷菌中的瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacterruminantium)在低饲料转化率奶牛瘤胃中的相对丰度较高，易导致产生过多CH4造成能量的浪费[34]。同时，相关研究指出瘤胃微生物组成与奶牛乳品质也存在联系，厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度之比与乳脂率有很强的相关关系[35]。然而，这些研究可能忽略了遗传因素和饲粮因素在其中的混杂作用，并缺少微生物与宿主性状相关的直接证据，这导致瘤胃微生物是决定反刍动物高低效率的结论存在挑战。

毋庸置疑，瘤胃内容物微生物在反刍动物能量利用方面起着重要作用。除瘤胃微生物之外，瘤胃上皮在VFA等营养物质的吸收转运代谢及机体免疫等生理过程起着重要作用，可维持瘤胃稳态并为机体供能，因此瘤胃组织的生理活动也是决定饲料转化效率的重要环节。瘤胃对营养物质的消化吸收并不是独立存在的，而是处于一种动态平衡，只有当高效消化(微生物)和高效吸收(上皮)达到一个完美的动态平衡时，才能保证营养物质的高效转化，当吸收速度跟不上消化速度易是，将导致营养代谢疾病并造成能量的浪费。随着单细胞测序技术以及组学技术的广泛应用，瘤胃营养与高效生产的关系也进入到了分子层面[33,36]。Xue等[13]基于这些技术发现了纤维降解过程中的关键瘤胃微生物基因和上皮细胞亚型在VFA的吸收过程中发挥重要作用，为瘤胃微生物与宿主互作对高效性状的贡献提供了更有说服力的描述。但是，这些与饲料转化效率密切相关的瘤胃微生物和上皮基因是否可以作为生物育种的关键标记物还有待进一步验证，这也是反刍动物消化道营养研究面临的重要挑战。

2.2 瘤胃营养生理与反刍动物健康

瘤胃微生物群落在进化上已适应消化和代谢富含植物纤维的草食性饲粮。然而，在现代反刍动物生产中，为了追求高效益，养殖者常大量使用高谷物饲粮，这导致了瘤胃菌群和代谢紊乱，破坏了瘤胃稳态，引发带来一系列健康问题，如亚急性瘤胃酸中毒(SARA)、瘤胃炎、肝囊肿、蹄叶炎，最终损害动物健康和牧场效益[37-38]。作为国内外广泛关注的研究话题，知名的反刍动物营养生理研究团队德国柏林自由大学Jörg R. Aschenbach教授团队、加拿大萨斯喀彻温大学Gregory B Penner教授团队、奥地利维也纳兽医大学大学Qendrim Zebeli教授团队以及国内南京农业大学毛胜勇教授团队、西北农林科技大学姚军虎教授团队、扬州大学王洪荣教授团队、内蒙古畜牧科学院高民教授团队都做了大量深入的研究工作。SARA最根本的特征是瘤胃VFA积累导致的瘤胃pH下降，多年以来，针对该病的预防和调控主要是改善瘤胃发酵、提高瘤胃pH。如添加碳酸氢钠和氧化镁等碱性缓冲剂、使用离子载体类抗生素莫能菌素等调控瘤胃内有机酸的产生和利用、直接饲喂酵母培养液及饲粮添加硫胺素调控瘤胃发酵等[39-40]。最近，Jiang等[41]在揭示反刍动物胃肠道微生物合成微生素B和维生素K2的机制基础上，进一步比较了饲粮结构变化对奶牛瘤胃中微生素B和维生素K2合成的影响规律，发现饲喂高精料饲粮显著降低了奶牛瘤胃中钴胺素合成相关微生物基因的总相对丰度，暗示钴胺素可能也是调控奶牛瘤胃酸中毒的重要途径。成年反刍动物具有相对复杂且稳定的微生物区系，从饲料原料来源、组成、加工方式等微生物营养底物差异角度出发可能将产生更好的调控效果。

3 小结与展望

随着测序技术的快速发展，瘤胃营养生理研究逐渐深入，但由于饲粮营养-微生物-宿主之间存在复杂的互作网络，导致对该研究领域的认识仍存在诸多问题和挑战。首先，在瘤胃微生物认识方面，多组学技术增强了研究人员对反刍动物瘤胃微生物的宏观认知，但是在其相互作用关系及如何分工协作共同发挥重要生理功能方面还需要进一步佐证完善。瘤胃微生物基因组的测序和组装是改进瘤胃微生物分离培养和未来人为调控的重要一步，目前主要集中在细菌等原核生物的组装，未来还需进一步克服关于真核生物的组装技术难点。关于反刍动物瘤胃微生物的研究大多集中在内容物，而对黏附于上皮的微生物功能知之甚少，由于其与宿主直接接触，可能对宿主的特定生理功能起着重要作用，值得进一步探索。其次，在瘤胃组织生理研究方面，由于瘤胃上皮结构的复杂性和特殊性，对其基本生物学功能及生理作用的认识还不够充分，这将阻碍反刍动物消化道营养的更深入认识。近年来，随着单细胞测序技术的快速发展，对瘤胃组织细胞组成及功能有了更为深入的认识，但相关验证试验还十分缺乏，没有强有力的证据支撑组学数据所得出的结论。因此，建立瘤胃上皮单细胞体外培养体系，证实单细胞功能及细胞与细胞之间的相互竞争和协作关系显得尤为重要。更为重要的是，由于反刍动物饲粮组成、瘤胃微生物组成功能及瘤胃上皮生理的多重复杂性，导致反刍动物瘤胃营养物质-微生物-宿主互作研究面临巨大挑战，基于上述互作路径开发的新的有效的反刍动物饲料添加剂也十分有限。营养底物是消化道微生物生存的根本，大部分微生物组成和功能的变化都是源于其所利用底物或营养的变化导致，因此，在充分认识瘤胃微生物代谢功能的基础上，利用特定营养底物对功能微生物进行富集，其代谢产物再对瘤胃上皮生理进行调控，将是可行的有效手段。