蒸桑寄生和宽筋藤药材质量标准的改进

刘 鑫 杨 雪 孙晓雪 王 昊 马世威崔 方 赵 杰 张加余 王志斌 王少平

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003；2北京中研同仁堂医药研发有限公司 北京 100075

桑寄生为桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.)Danser的干燥带叶茎枝，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎元等功效[1]。它是我国常用传统中药材，最早可追溯到《神农本草经》[2]。其寄主来源复杂、药材基原来源多样，自然状态下，桑寄生的寄主可有桑树、柳树、夹竹桃、漆树等多科多属多种植物。某些寄主的桑寄生还拥有毒性，影响了桑寄生药材使用效果甚至用药安全[3]。桑寄生的炮制方法在古代炮制文献中记载较少，《雷公炮炙论》中载：“(桑寄生)采得后，用铜刀和根、枝、茎细锉，阴干了任用。勿令见火”[4]。现今多用生桑寄生和酒桑寄生两种，亦有地方炮制规范及研究采用蒸制[5]或醋制[6-7]。蒸法是中药传统炮制中常用方法之一，可以缓和生药燥烈之性、去除毒性、增强药性，同时便于制剂、贮藏[8]。现行《中国药典》中只有生桑寄生的质量规范，各地方中药材质量标准中也只有《福建省中药饮片炮制规范》[5]中有蒸桑寄生的载录。本研究对蒸桑寄生的炮制方法及质量标准进行研究，将有助于丰富《药典》内容，为蒸桑寄生质量标准的制定提供依据。

宽筋藤又名松根藤、大接筋藤、舒筋藤、牛挣藤、大松身，为防己科青牛胆属植物中华青牛胆Tinosporasinensis(Lour.)Merr的干燥茎，具有舒筋活络、祛风止痛作用，始载于清代岭南本草《生草药性备要》[9]。宽筋藤在民族医学尤其是藏医藏药中最为常用，是藏族地区防治衰老的常用药[10]，但其基础研究不足，物质基础不明[11]。现行《药典》中尚未载录宽筋藤药材质量标准，各地方中药材标准[12-15]中对宽筋藤也多只是规范了显微鉴别或显色反应鉴别。本研究采用显微鉴别、薄层色谱鉴别以及水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物等项目的测定，对《药典》相关质量标准的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 显微镜(奥林巴斯株式会社)、中药材粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)、分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)、烘箱(上海一恒科学仪器有限公司)、水分测定仪(上海佑科仪器仪表有限公司)、恒温水浴锅(常州德科仪器制造有限公司)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2 药物与试剂 甲酸、乙醇、甲苯、乙醚、乙酸乙酯(天津市富宇精细化工有限公司)，三氯甲烷(烟台三和化学试剂有限公司)，甲酸乙酯、甲醇(国药集团化学试剂有限公司)，水合氯醛(天津市瑞金特化学品有限公司)，三氯化铝(天津市大茂化学试剂厂)，硫酸钠(天津市北辰方正试剂厂)，乙酸铅(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，3,5-二硝基苯甲酸(上海麦克林生化科技有限公司)(以上试剂均为分析纯)。槲皮素对照品(成都普瑞法科技开发有限公司，批号BP1187)。10批次蒸桑寄生饮片及10批次宽筋藤饮片来源见表1、2。

表1 蒸桑寄生样品收集情况

表2 宽筋藤样品收集情况

1.3 实验方法

1.3.1 显微鉴别 将各批次蒸桑寄生或宽筋藤饮片用粉碎机制成粉末置于洁净的载玻片上，加10%水合氯醛数滴，混匀后移至酒精灯火焰上5～6 cm处，匀速同方向摇晃并观察水合氯醛沸腾情况，以边缘微沸稍干向内收缩为一次透化标准，重复透化2～3次；放凉，滴加1～2滴蒸馏水，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余水分，进行显微观察。

1.3.2 定性鉴别

1.3.2.1 蒸桑寄生

1.3.2.1.1 样品溶液的制备 取本品粉末5 g,加甲醇-水(1∶1)60 mL，加热回流1 h，趁热滤过，滤液浓缩至约 20 mL后，加水10 mL，再加稀硫酸约0.5 mL，煮沸回流1 h后，用乙酸乙酯振摇提取参2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，浓缩至约l mL，作为供试品溶液。

1.3.2.1.2 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品，加乙酸乙酯溶解制成 0.5 mg/mL 溶液，作为对照品溶液。

1.3.2.1.3 薄层色谱方法考察 参照薄层色谱法(《药典》2020年版[1]四部通则0502)试验，对薄层色谱法各影响因素进行考察。硅胶板考察分别选取青岛海洋和烟台江友系列预制薄层板作为点样材料；点样量为1 μL，采用甲苯(水饱和)-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)为展开剂进行展开。展开剂考察采用甲苯∶甲酸乙酯=5∶4、甲苯(水饱和)∶甲酸乙酯∶甲酸=5∶4∶1、甲苯:甲酸乙酯:甲酸=5∶4∶2作为展开剂，对蒸桑寄生各批次饮片的样品溶液和槲皮素对照品溶液进行薄层试验。点样量的考察采用青岛海洋预制硅胶G薄层板为薄层展开板，以甲苯(水饱和)∶甲酸乙酯∶甲酸=5∶4∶1作为展开剂，以蒸桑寄生各批次饮片、槲皮素对照溶液为研究对象，对点样量进行考察，点样量为0.5、1和3 μL。展开温度的考察，在不同温度下对各批次的蒸桑寄生薄层行为进行考察。饱和状态考察，对蒸桑寄生各批次饮片的薄层展开进行饱和状态考察，考察条件为展开前饱和30 min和展开前不饱和。

1.3.2.2 宽筋藤

1.3.2.2.1 样品溶液的制备 取本品粉末l g，加乙醇 20 mL，加热回流2 h，滤过，滤液浓缩至l mL，作为供试品溶液。

1.3.2.2.2 对照品溶液的制备 取宽筋藤对照药材l g，加乙醇20 mL，加热回流2 h，滤过，滤液浓缩至l mL，作为对照药材溶液。

1.3.2.2.3 薄层色谱方法考察 参照薄层色谱法(《药典》2020年版[1]四部通则0502)试验，对薄层色谱法各影响因素进行考察。硅胶板考察分别选取青岛海洋和青岛谱科系列预制薄层板作为点样材料；点样量为15 μL，采用甲苯:乙酸乙酯:甲酸(6∶4∶1)为展开剂进行展开。展开剂考察采用甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(5∶4∶1)、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(6∶4∶0.5)和甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(7∶4∶1)作为展开剂，对宽筋藤各批次饮片和宽筋藤对照药材溶液进行薄层试验。点样量考察采用青岛谱科预制硅胶G薄层板为薄层展开板，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)作为展开剂，以宽筋藤各批次饮片、宽筋藤对照药材为研究对象，对点样量进行考察，点样量为10、12、15和16 μL。展开温度考察，在60℃、5℃和室温下对各批次的宽筋藤薄层行为进行考察。饱和状态考察，对宽筋藤各批次饮片的薄层展开进行饱和状态考察，考察条件为展开前饱和30 min和展开前不饱和。

1.3.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量考察 对10批次蒸桑寄生及10批次宽筋藤药材饮片按《中国药典》2020年版[1]四部通则0832第二法(烘干法)测定水分；按通则2302测定灰分、酸不溶性灰分；按通则2201采用水冷浸、水热浸、乙醇冷浸、乙醇热浸法测定浸出物。

1.3.4 蒸桑寄生饮片强心苷检查 参照《北京市中药饮片炮制规范》2008年版[12]桑寄生饮片强心苷检查项下方法对蒸桑寄生各批次饮片中的强心苷进行鉴别：取饮片粉末10 g，加80%乙醇50 mL，加热回流30 min，过滤取滤液蒸干，热水10 mL复溶，过滤，滤液加15 mL乙醚振摇提取4次，取水层加醋酸铅饱和溶液至沉淀完全，过滤，滤液加10 mL乙醇，加硫酸钠饱和溶液脱铅，过滤，滤液加15 mL三氯甲烷振摇提取3次，合并有机层浓缩至1 mL。浓缩液点于滤纸上，干后滴加碱性3,5-二硝基苯甲酸溶液，观察是否显色。

2 结果

2.1 蒸桑寄生

2.1.1 显微鉴别 蒸桑寄生饮片粉末呈淡黄棕色。镜下观察到4个蒸桑寄生的显微特征：石细胞，星状细胞，导管，草酸钙结晶。石细胞类方形、类圆形，偶有分支，壁三面厚，一面薄，含草酸钙方晶。纤维成束，直径约17 μm。具缘纹孔、网纹及螺纹导管多见。屋状毛分枝碎片少见(图1)。

2.1.2 薄层色谱定性鉴别

2.1.2.1 硅胶板考察结果 青岛海洋较烟台江友薄层板的斑点清晰，且Rf值适中(图2)。经综合考察，最终选择青岛海洋预制硅胶G薄层板。

2.1.2.2 展开剂考察结果 蒸桑寄生各批次饮片和对照品溶液在甲苯(水饱和)∶甲酸乙酯:甲酸=5∶4∶1展开剂下分离效果更好，且斑点清晰，Rf值适中(图3)。因此，最终选择甲苯(水饱和)∶甲酸乙酯∶甲酸=5∶4∶1作为展开剂。

图1 蒸桑寄生饮片显微结果

2.1.2.3 点样量考察结果 0.5和1 μL点样下薄层板斑点清晰，效果较好；3 μL点样下斑点暗淡，分离效果欠佳(图4)。因此，点样量确定为1 μL。

2.1.2.4 展开温度考察结果 在三个温度下蒸桑寄生各批次样品的薄层色谱展开效果差异不大(图5)，因此，最终并未对展开温度进行限定。

2.1.2.5 饱和状态考察结果 经展开前饱和后的蒸桑寄生各批次饮片薄层展开效果较好，未进行饱和后展开的斑点存在叠加现象(图6)。因此，确定饱和条件为展开前饱和30 min。

1.为槲皮素对照品；2～6.不同批次蒸桑寄生饮片。

1.为槲皮素对照品；2～6.不同批次蒸桑寄生饮片。

1.为槲皮素对照品；2～6.不同批次蒸桑寄生饮片。

1.为槲皮素对照品；2～6.不同批次蒸桑寄生饮片。

1.为槲皮素对照品；2～6.不同批次蒸桑寄生饮片。

2.1.2.6 验证试验 依据以上方法考察结果，本研究采用以下条件对各批次蒸桑寄生进行验证。薄层板采用青岛海洋化工厂生产的预制硅胶G薄层预制硅胶板，厚度为0.20～0.25 mm，批号为20210323。展开剂为甲苯(水饱和):甲酸乙酯:甲酸=5∶4∶1。检视喷以5%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)。在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点(图7)。

1.为槲皮素对照品溶液；2～11.不同批次蒸桑寄生饮片。

2.1.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物考察 10批次蒸桑寄生水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物测定结果见表3、4。根据10批样品测定结果，本研究认为，蒸桑寄生水分不得过12.0%，总灰分不得过5.0%，酸不溶性灰分不得过1.0%，乙醇热浸法浸出物限度为不得低于5.0 %。

2.1.4 强心苷检查 蒸桑寄生强心苷检查结果显示，10批饮片均不显紫红色(图8)，符合《北京市中药饮片炮制规范》下桑寄生质量标准。

表3 蒸桑寄生水分、总灰分和酸不溶性灰分测定结果/%

表4 蒸桑寄生浸出物测定结果/%

2.2 宽筋藤

2.2.1 显微鉴别 宽筋藤饮片粉末呈浅灰色。镜下观察到导管、木纤维、腺毛3个宽筋藤的显微特征。木栓细胞表面观多角形，淡黄棕色。网纹导管直径为60～400 μm，螺纹导管直径为15～30 μm。石细胞类圆形至多角形，直径为20～40 μm，内含草酸钙方晶。木纤维壁具人字形纹孔。韧皮纤维成束，木化，周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶鞘纤维。淀粉粒单粒类圆形或椭圆形，直径为3～20 μm。复粒少数，由2～3分粒组成(图9)。

2.2.2 薄层色谱定性鉴别

2.2.2.1 硅胶板考察结果 青岛海洋较烟台江友薄层板的斑点清晰，且Rf值适中(图10)。经综合考察，最终选择青岛海洋预制硅胶G薄层板。

图8 蒸桑寄生强心苷鉴别结果

图9 宽筋藤饮片显微观察结果

1、10.宽筋藤对照药材；2～9、11、12.宽筋藤饮片。

2.2.2.2 展开剂考察结果 宽筋藤各批次饮片和对照药材溶液在甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)展开剂下分离效果更好，且斑点清晰，Rf值适中(图11)。因此，最终选择甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)作为展开剂。

1.宽筋藤对照药材；2～6.宽筋藤饮片。

2.2.2.3 点样量考察结果 12、15和16 μL点样下薄层板斑点清晰，效果较好，10 μL点样下斑点暗淡，分离效果欠佳(图12)。因此，点样量确定为15 μL。

1.宽筋藤对照药材；2～6.宽筋藤饮片。

2.2.2.4 展开温度考察结果 在三个温度下宽筋藤各批次样品的薄层色谱展开效果差异较大。其中60℃下斑点不明显，且分离度不佳，5℃下存在明显的边缘效应导致斑点不整齐(图13)。因此，最确定展开温度为常温。

1.宽筋藤对照药材；2～6.宽筋藤饮片。

2.2.2.5 饱和状态考察结果 经展开前饱和后的宽筋藤各批次饮片薄层展开效果较好，未进行饱和后展开的斑点存在叠加和边缘效应现象(图14)。因此，确定饱和条件为展开前饱和30 min。

2.2.2.6 验证试验 本研究依据以上方法考察结果，采用以下条件对各批次蒸桑寄生进行验证。薄层板采用青岛谱科化工厂生产的预制硅胶G薄层预制板，厚度为0.20～0.25 mm，批号为20210323。展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)。检视喷以5%磷钼酸乙醇溶液。在105℃下加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点(图15)。

1.宽筋藤对照药材；2～6.宽筋藤饮片。

1～8、10、11. 宽筋藤饮片；9.宽筋藤对照药材。

2.2.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物考察 10批次宽筋藤饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物考察结果见表5、6。根据10批样品测定结果，本研究认为：宽筋藤水分不得过13.0%，总灰分不得过10.0%，酸不溶性灰分不得过5.0%，水热浸法浸出物限度为不得低于10.0 %。

表5 宽筋藤水分、总灰分和酸不溶性灰分测定结果/%

表6 宽筋藤浸出物测定结果/%

3 讨论

本研究通过观察蒸桑寄生和宽筋藤饮片及粉末的显微特征，掌握了显微鉴定蒸桑寄生和宽筋藤的要点，为两种药材的显微鉴别提供了参考。

本研究对薄层板厂家(青岛海洋、青岛谱科、烟台江友)、点样量(10、12、15、16 μL)、展开剂乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(5∶4∶1)、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(6∶4∶0.5)和甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(7∶4∶1)、展开温度(5℃、常温、60℃)饱和状态(饱和、不饱和)等薄层色谱条件进行了考察，最终确定了蒸桑寄生和宽筋藤的薄层色谱鉴别方法，该方法方法色谱斑点清晰、专属性强、稳定性好、耐用性强。

本研究在对水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量测定的测定中，得出以下质量标准：蒸桑寄生水分不得过12.0%，总灰分不得过5.0%，酸不溶性灰分不得过1.0%，乙醇热浸法浸出物限度为不得低于5.0 %；宽筋藤水分不得过13.0%，总灰分不得过10.0%，酸不溶性灰分不得过5.0%，水热浸法浸出物限度为不得低于10.0 %。

本研究通过对蒸桑寄生和宽筋藤进行显微鉴别、薄层色谱鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物和强心苷含量测定，系统地考察了两种药材的各项质控指标，结合《药典》和各地两种药材的质量要求，制定了质量标准，为今后两种植物药的质量控制提供了参考依据。