产纤维素酶霉菌筛选及发酵条件优化

干建松

（1.江苏财经职业技术学院 粮食与食品药品学院，江苏 淮安 223003；2.中国矿业大学 化工学院，江苏 徐州 221116）

农作物秸秆是世界上最丰富的纤维素类可再生资源[1-2]，同时也是世界上年产量最多的农业副产品，据不完全统计，2014～2018年，中国秸秆年均产量高达6.537 8×108t，其中谷类、麦类和玉米秸秆产量分别占32.3%、22.7%和45.0%[3-4]。在我国，大量秸秆往往被就地焚烧，不但污染了环境，而且造成秸秆资源的浪费。近年来，虽然开发出一些新的秸秆利用技术，但是由于技术瓶颈，秸秆的利用仍然存在转化利用率低、时间长、成本偏高等问题。秸秆的主要成分纤维素、木质素等，是可再生资源的重要组成部分。纤维素的降解和转化利用可以通过纤维素酶的作用进行，不但能耗低，而且反应温和，且不像化学方法那样会产生对环境有污染的物质。

我国是农业生产大国，但在秸秆利用方面较差，开发利用较少[5]，纤维素酶能将天然纤维素降解，生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖，高产纤维素酶微生物的筛选对解决这些问题十分重要[6-8]，然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下，从而造成生产成本过高[9]。因此，筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株及相关研究是当前研究的热点和难点[10-11]。若能将秸秆合理利用，其潜力巨大，前景广阔[12-13]。

国内外对高产纤维素酶的微生物开展了大量的研究工作，左勇等[14]以羧甲基纤维素钠为培养基的唯一碳源，从酒糟中分离纯化出一株具有产纤维素酶能力的维氏芽孢杆菌P-7；傅科鹤等[15]从土壤中分离纯化获得一株高产纤维素酶的菌株TW063-3，通过形态学结合分子生物学鉴定得出，该菌株为草酸青霉，经过试验优化，酶活比优化前提高了34.1%；何深宏等[16]从牛粪堆肥样品中分离得到的57株菌株中筛选出10株有较高纤维素酶活力，其中菌株X10纤维素酶活力最高，为31.9 U/mL，菌株X10鉴定为解淀粉芽孢杆菌；兰时乐等[17]从腐木上分离并筛选出1株具有较高纤维素酶活力的菌株TP01，并将其鉴定为绿色木霉，对该菌株进行诱变处理，获得了1株高产纤维素酶的突变菌株TP1202，发现TP1202对纤维素的降解活性高于野生型菌株TP01；王靖等[18]从快速腐烂的苎麻基质中筛选到1株产纤维素酶活力较高的菌株F1-1，分析该菌株的遗传背景，并对其产酶条件进行了优化；但由于各种原因，均未能应用。本文利用传统微生物学方法从自然界筛选出一株性能稳定、高产纤维素酶的纤维素降解菌，并对其产酶条件进行优化，旨在为其实际应用提供一定的技术支撑。对于木质纤维原料的应用工艺的研究和开发，对于实现经济可持续性发展和环境保护有着极其重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要试剂

磷酸二氢钾（分析纯）：宜兴市第二化学试剂厂；蛋白胨（生物试剂）：上海东海制药股份有限公司；刚果红、羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）（均为分析纯）：中国医药（集团）上海化学试剂公司；硫酸镁（分析纯）：上海试四赫维化工有限公司；3，5-二硝基水杨酸（分析纯）：湖州生物化学有限公司；无水乙醇（分析纯）：江苏永丰化学试剂有限公司；无水葡萄糖（分析纯）：成都化学试剂厂；酒石酸铵（分析纯）：浙江宁海县有机化工厂；过氧化氢（分析纯）：无锡市亚盛化工有限公司；溶壁酶（生物试剂）：广东微生物研究所；纤维素酶（≥300 U/mg）：德国SERVA公司；崩溃酶（≥3 U/g）：芬卡国际贸易（上海）公司。

1.1.2 霉菌自然样本采集

除去地表植被和枯枝落叶后，取表面4 cm～5 cm左右的表土，来源于江苏淮安清江浦区富丽花园西部柳树湾保护区树林。

1.1.3 培养基

富集培养基、种子培养基：羧甲基纤维素钠10.00g，蛋白胨2.00 g，磷酸二氢钾1.00 g，硫酸镁0.50 g，水1 L，pH自然。

筛选培养基：CMC-Na 10.00 g，蛋白胨2.00 g，磷酸二氢钾1.00g，硫酸镁0.50g，刚果红0.03g，琼脂18.00g，水1 L，pH自然。

产酶发酵培养基：秸秆粉10.00 g，硫酸铵2.00 g，磷酸二氢钾1.00 g，硫酸镁0.50 g，吐温-80 5 mL，水1 L，pH 自然。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g（切片，沸水煮30 min，6层纱布过滤），葡萄糖20 g，磷酸二氢钾0.3 g，七水硫酸镁0.15 g，琼脂18 g，补水至水1 L，pH自然。

1.2 仪器与设备

电热恒温培养箱（DNP-9052）：上海精宏实验设备有限公司；数显恒温水浴锅（HH-6）：金坛市富华电器有限公司；自动立式电热压力蒸汽灭菌器（LDZX型）：上海申安医疗器械厂；电子天平（FA2004）：上海精密科学仪器有限公司；恒温摇床（DHZ-C）：江苏太仓市实验设备厂；分光光度计（721型）：上海棱光技术有限公司；摇床（MJ-106）：上海福玛实验设备有限公司；冰箱（BCD-215C型）：青岛海尔冷冻柜总公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种筛选

1.3.1.1 富集培养

取10 g的土壤样品加入装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，150r/min，28℃振荡20min，制成土壤悬液，吸取3mL土壤悬液置于富集培养基中，150r/min，28℃，培养2 d。

1.3.1.2 菌株初步筛选

将富集培养后的菌悬液，按10倍法稀释，稀释至10-8。将上述稀释液（10-5～10-8）涂布于筛选培养基平板，28℃培养3 d，观察是否产生透明圈。挑取有透明圈的菌落，用接种针在平板上划线，再次分离筛选，重复3次～4次。平板划线分离后，挑取单菌落接入斜面，28℃恒温培养2 d～3 d后，于4℃冰箱保存备用。

1.3.1.3 菌株复筛

初筛后菌株平板培养3 d后，接入PDA培养基活化，而后接入产酶发酵培养基中，28℃、150 r/min发酵3 d，后每隔24 h测定一次酶活力。选取发酵酶活力高的菌株进行后续试验。

1.3.1.4 纤维素酶高产菌株诱变

种子液培养2 d，过滤收集菌丝体，刮取2勺菌丝体于酶解液中，28℃，220 r/min酶解2 h～3 h，从2 h开始镜检观察原生质体制备情况，酶解结束后，过滤收集原生质体滤液，5 000 r/min离心10 min，收集原生质体，用0.6 mol/L氯化钠冲洗2遍并重悬至10 mL，分别稀释50倍、100倍备用。将稀释好的原生质体溶液分别取 100 mL 涂布，进行 0、1、2、3、4、5 min 紫外照射，每个时间梯度2个平板，28℃培养，分别记录单菌落数量，绘制致死率曲线，确定最佳诱变时间。挑取单菌落进行后续发酵验证。所有试验均重复3次，取平均值。

1.3.2 纤维素酶酶活力的测定

1.3.2.1 葡萄糖标准曲线的测定

将无水葡萄糖粉末置于105℃烘箱烘至恒重，精确称取0.108 g葡萄糖，蒸馏水定容至100 mL，配制浓度6 μmol/mL葡萄糖标准溶液备用。分别取6 μmol/mL葡萄糖标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于具塞试管中，加蒸馏水定容至2.5 mL，分别加1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂[19]，沸水浴中加热5 min，流水冷却。再用蒸馏水稀释10倍，混匀后以空白管为对照，530 nm测OD值。以葡萄糖微摩尔数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

1.3.2.2 粗酶液的制备

从冰箱中取出备用的菌株，接入PDA培养基活化，而后接入产酶发酵培养基中，在28℃、150 r/min摇床产酶发酵，取发酵液2 000 r/min离心l5 min，上清液即为粗酶液。

1.3.2.3 酶活力测定

根据葡萄糖回归方程和测得的OD值，可由公式（1）计算纤维素酶活力。酶活力单位（U）：标准状态下，每分钟从底物溶液中释放1 μmol葡萄糖所需的酶量称为一个酶活力单位。这里所指标准状态通常是指酶反应最佳条件。

式中：10为酶与底物作用时间，min。

1.3.2.4 CMC法测纤维素酶活力

取含有0.05 mol/L CMC-Na的醋酸缓冲液1 mL于5 mL离心管中，加入粗酶液0.50 mL，50℃酶解10 min，1 mL 10%NaOH终止反应，加入1.50 mL DNS试剂，沸水加热5 min，流水冷却，稀释10倍，530 nm测OD值，根据葡萄糖标准曲线，求得每毫升酶液酶解产生的葡萄糖摩尔数[20-22]，空白为0.50 mL粗酶液，先经1 mL 10%NaOH处理，其他操作同样品的测定。

1.3.2.5 滤纸酶（filter paper activity，FPA）活力测定

于试管中加pH4.5柠檬酸缓冲液1mL，再加入1张卷曲的滤纸条（1 cm×3 cm），50℃预热 5 min，在试管中加入0.5 mL酶液，50℃保温10 min，1 mL 10%NaOH终止反应，加入1.50 mL显色液，再沸水浴5 min，流水冷却终止反应，用蒸馏水稀释10倍，同时用失活的酶做对照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活。530 nm测OD值，根据葡萄糖标准曲线得到酶单位[21]。FPAase酶活力的定义：1个酶活力单位是指在50℃与pH4.8的条件下，每分钟分解产生1 μmol葡萄糖所对应的酶量。

1.3.2.6 外切型-β-葡聚糖（circumscribed type-βglucanase，C1）酶活力的测定

取1%的微晶纤维素溶液1.0 mL作为底物，溶剂为0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液，加入0.5 mL适当稀释的纤维素酶溶液，于50℃下反应10 min后，立即用1 mL 10%NaOH终止反应，加入1.50 mL DNS试剂，沸水浴5 min显色，流水冷却终止反应，用蒸馏水稀释10倍，530 nm测OD值，并从葡萄糖标准曲线得出相应的葡萄糖浓度，折算成酶单位。同时用失活的酶作对照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活，其余均与上面步骤一致。

1.3.2.7 β-葡萄糖苷（β-glucosidase，BG）酶活力的测定

取1%的水杨甘（素）溶液1.0 mL作为底物，溶剂为0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液，加入0.5 mL适当稀释的纤维素酶溶液，50℃反应10 min，1 mL 10%NaOH终止反应，加入1.50 mL DNS试剂，沸水浴5 min显色，流水冷却终止反应，用蒸馏水稀释10倍，530 nm测OD值，并从葡萄糖标准曲线得出相应的葡萄糖浓度，折算成酶单位。同时用失活的酶作对照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活，其余均与上面步骤一致。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 培养基试验

采用菌种复筛发酵条件，分别将氮源调整为硫酸铵、硝酸铵、蛋白胨、尿素、酵母膏，最终含氮量为0.8%，以研究不同氮源对菌株产酶的影响；分别将诱导物（用量10 g/L）调整为玉米芯提取物、秸秆粉、麸皮，以研究不同物质对菌株诱导产酶的影响。

1.3.3.2 单因素爬坡试验

将最适氮源的质量浓度调至1 g/L～3 g/L，最适诱导物的质量浓度调至5 g/L～15 g/L，磷酸二氢钾质量浓度 0.5 g/L～1.5 g/L、硫酸镁 0～1 g/L，吐温-80 0～10 mL/L，以研究氮源、诱导物、磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温-80对菌株产酶的影响。试验设计见表1。

表1 最陡爬坡试验设计Table 1 Experimental design of steepest climbing

1.3.4 中心组合设计试验

根据单因素爬坡试验结果，对秸秆粉、蛋白胨、吐温-80进行Box-Benhnken试验，每个因素取3个水平，响应值为纤维素酶活力，试验设计见表2。

表2 响应面试验设计Table 2 Response surface experiment design

1.4 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示（n=3），采用origin 8.0和Design-expert软件对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

从土壤样本中共筛得到8株菌株，其中有3株（S-1、S-2、S-3）可在初筛培养基中培养后产生透明圈，3株菌菌丝和孢子的形态如图1所示。

图1 3株菌的菌丝、孢子Fig.1 Hyphae and spores of 3 strains of bacteria

2.2 纤维素酶活力

根据葡萄糖标准溶液在OD530的吸光值，绘制标准曲线（图 2），线性回归方程：y=0.077x-0.020，R2=0.997。

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 Glucose standard curve

通过液体产酶发酵试验，获得了菌株S-1、S-2、S-3的4种酶活力，结果如表3所示。

表3 不同菌株纤维素酶活力Table 3 Cellulase activity of different strains U/mL

综合比较S-1、S-2和S-3试样的各类酶活力，可知S-2菌株试样的酶活力整体上高于另外两株试样的酶活力，因此选择S-2菌株作为后继研究菌株。

2.3 高产菌株诱变及遗传稳定性

2.3.1 高产菌株紫外诱变

记录紫外诱变 0、1、2、3、4、5 min 后单菌落的数量，绘制致死率曲线，结果如图3所示。

图3 致死率曲线Fig.3 The lethality curve

由图3可知，照射4 min时，致死率可达70%以上，因此确定4 min为最佳诱变时间。紫外诱变后选取水解圈直径较大的菌株进行扩大培养，分别编号为SUV2-1、SUV2-2、SUV2-3、SUV2-4，SUV2-5，SUV2-6，进行发酵产酶试验3次，测定平均酶活力，结果如图4～图7所示。

由图4～图7可知，SUV2-1产C1酶活力最大，可达0.64 U/mL，SUV2-2产BG酶活力最大可达1.52 U/mL，SUV2-3产CMC酶和FPA酶活力最大，分别达到0.52 U/mL和0.35 U/mL。

图4 诱变后菌株的CMC酶活力Fig.4 CMC activity of the mutagenized strain

图5 诱变后菌株的C1酶活力Fig.5 C1 activity of the mutagenized strain

图6 诱变后菌株的BG酶活力Fig.6 BG activity of the mutagenized strain

图7 诱变后菌株的FPA酶活力Fig.7 FPA activity of the mutagenized strain

2.3.2 遗传稳定性试验

将诱变后的菌株进行传代培养，菌株的酶活力如表4所示。

表4 传代培养的4代菌株的活力Table 4 Enzyme activity of the four generations of subcultured strains U/mL

从表3可以看出，SUV2-1菌株4种酶都略有降低，但较为稳定；SUV2-2和SUV2-3两株菌分别有BG、CMC的最大酶活力，分别为1.48 U/mL和0.52 U/mL但其并不稳定，且其他酶活力并不理想；SUV2-4、SUV2-5、SUV2-6 3株菌酶活力都相对较低。综上来看，此次紫外诱变SUV2-1菌株酶活力明显提高，CMC酶活力最大达到0.48 U/mL，相对诱变前提高了9.58%；C1酶活力最大达到0.57 U/mL，相对提高了32.69%；BG酶活力最大达到1.37 U/mL，相对提高了52.60%；FPA酶活力最大达到0.30 U/mL，相对提高了40.93%，且较为稳定。将SUV2-1菌株保藏，进行产酶条件的优化试验。

2.3.3 单因素试验结果

单因素试验结果见图8～图11。

由图8可知，不同氮源对SUV2-1产酶的影响不同，添加蛋白胨效果最佳，酵母膏次之，添加尿素的效果最差。纤维素酶是一种诱导酶，因此在发酵过程中通常需要添加诱导物以提高发酵产酶水平，如图10可知，使用秸秆粉的CMC酶活力最大达到0.45 U/mL，3种诱导物中最高，C1酶活力最高达到0.45 U/mL，FPA酶活力最高达到0.21 U/mL，BG酶的诱导作用达到最大值0.90 U/mL，效果最为明显。综合以上4种酶活力，因此秸秆粉诱导作用更为明显。

图8 氮源对发酵产酶的影响Fig.8 Effect of nitrogen source on enzyme production

图9 诱导物玉米芯提取物对发酵产酶的影响Fig.9 Effect of the inducer corncob extract on enzyme production

图10 诱导物秸秆粉对发酵产酶的影响Fig.10 Effect of inducer straw powder on enzyme production

图11 诱导物麸皮对发酵产酶的影响Fig.11 Effect of inducer bran on enzyme production

2.3.4 单因素爬坡试验

选择单因素试验中产酶效果最好的蛋白胨、秸秆粉，以及培养基中其它组分磷酸二氢钾、硫酸镁、吐温-80进行单因素爬坡试验，结果如图12～图16所示。

图12 蛋白胨对SUV2-1产纤维素酶的影响Fig.12 Effect of peptone on the production of cellulase from SUV2-1

图13 秸秆粉对SUV2-1产纤维素酶的影响Fig.13 Effect of straw powder on the production of cellulase from SUV2-1

图14 磷酸二氢钾对SUV2-1产纤维素酶的影响Fig.14 Effect of potassium dihydrogen phosphate on the production of cellulase from SUV2-1

图15 硫酸镁对SUV2-1产纤维素酶的影响Fig.15 Effect of magnesium sulfate on the production of cellulase from SUV2-1

图16 吐温-80对SUV2-1产纤维素酶的影响Fig.16 Effect of tween-80 on the production of cellulase from SUV2-1

由图12～图16可知，对产酶影响最大的3个因素分别为蛋白胨、秸秆粉和吐温-80，浓度分别在2、10 g/L和2.5 mL/L时产酶活力最高。

2.3.5 响应面试验设计优化

使用爬坡试验中获得的各因子对应的最适产酶浓度为中心点进行响应面设计并开展试验，结果如表5所示。回归模型方差分析见表6。

表5 响应面试验结果分析Table 5 Analysis of response surface experiment results

从表6中可以看出，复相关系数R2=96.05%，表明多项式模型方程具有较高的拟合程度，预测值和实测值之间具有较大的相关性；模型F=23.93，P=0.000 2，说明回归模型是显著的；失拟项F=0.42，P=0.746 1>0.05，说明失拟项是不显著的。可以用此模型对产纤维素酶菌株发酵产酶进行分析和预测。经过对试验数据的回归分析，得到二次多元回归方程：Y=0.43+0.023X1+0.024X2+0.013X3+0.031X1X2+0.004545X1X3+0.0006494X2X3-0.031X12-0.027X22-0.035X32。

表6 回归模型方差分析Table 6 Regression analysis of variance

根据响应面回归方程可以利用Design-Expert软件绘制响应曲面图，见图17～图19。

图17～图19直观地反映了各因素对响应值的影响，比较3组图可知：图18中AB对产酶的影响最为显著，表现为曲线较陡；图17中AC对产酶的影响较为显著，表现为曲线有一定陡峭；图19中BC对产酶的影响最小，表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值变化相对较小。综上可知：3个因素两两之间相互影响的主次关系：AB>AC>BC。

图17 秸秆粉和吐温-80含量交互作用对产酶的影响Fig.17 Effect of interaction between straw powder and Tween-80 content on enzyme production

图18 秸秆粉和蛋白胨含量交互作用对产酶的影响Fig.18 Effect of interaction between straw powder and peptone content on enzyme production

图19 吐温-80和蛋白胨含量交互作用对产酶的影响Fig.19 Effect of interaction between Tween-80 and peptone content on enzyme production

2.3.6 验证试验

根据Design-Expert软件预测结果，在秸秆粉、蛋白胨、吐温-80含量分别为11.63 g/L、2.33 g/L和2.71 mL/L的最佳条件下进行验证试验，3次试验平均值为0.46 U/mL，与预测值0.454 5 U/mL十分接近，充分说明模型是可靠的。

3 结论

本研究从自然界筛选以及紫外诱变获取性状优良的产纤维素酶菌株SUV2-1。结果表明，S-2经诱变后产不同种类纤维素酶（CM酶、FPA酶、C1酶、BG酶）的活力有所不同，可以根据实际应用情况，分别选择适合的菌株。单因素试验选择诱导物时，发现秸秆粉诱导作用较好，其原因有可能是秸秆粉含有的粗纤维高达30%以上，高于玉米芯及麸皮。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对培养基进行优化，得到菌株发酵最佳条件：秸秆粉、蛋白胨、吐温-80含量分别为11.63 g/L、2.33 g/L和2.71 mL/L，产生纤维素酶活力的最大值为0.46 U/mL。本研究为纤维素酶高产菌株的选育建提供了1株良好出发菌株，发酵优化结果为该菌株的后续放大发酵和应用研究奠定了基础。