4种植物提取物的体外抗氧化活性比较

徐韶棠，杨轶浠，*，王艺瑾，郭育涛，刘雅宁，张佳敏，覃小颖，张珏

（1.成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106；2.成都大学 肉类加工四川省重点实验室，四川 成都 610106；3.四川良源食品有限公司，四川 巴中 636000）

脂质氧化是影响食品品质的主要原因之一，其主要产物为醛、环氧脂肪酸、亚硝基化合物等物质。这些物质不仅会影响食物的感官品质，甚至可能产生有毒物质。目前使用抗氧化剂是食品抑制脂质氧化的主要方法之一[1-3]。然而人工合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯和叔丁基对苯二酚等在抗氧化剂中占主导地位[4]。近年来，人们对食品中所添加的人工合成抗氧化剂的安全性问题高度关注。一些研究表明合成抗氧化剂可能存在诸多副作用，会对人体的肝、脾、肺有不利影响，甚至可能会诱发恶性肿瘤等[5]。随着植物资源的开发和消费者对食品品质及安全的要求越来越高，取代有潜在安全风险的化学抗氧化剂已成为当今研究的热点[6]。

据报道，植物的抗氧化活性成分主要有黄酮类、多酚类、皂甙类、鞣质类、维生素类、褪黑素类等[7]。其中黄酮和多酚类化合物是许多植物提取物的主要抗氧化活性成分，并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗过敏等多种生物活性及药理作用[8-9]。因植物提取物在对抗氧化应激所引起的神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、炎症和糖尿病等各疾病的发病机制中起着重要作用[10]，故对植物的抗氧化活性研究具有重要意义。

分心木是核桃内的木质隔膜，性味苦涩，具有很高的药用价值和良好的抗氧化作用。但是经常被当作垃圾丢弃，造成很大的浪费[11]。2020年，赶黄草通过国家食品安全风险评估中心审查，批准为新食品原料，成为药食同源植物之一，其食用安全性受到认可。赶黄草作为一种药食同源植物，具有极高的药用价值，甚至被赋予了“神仙草”的美誉[12]。代代花分布广泛，资源丰富，同时具有很高的药用价值，但是有关于代代花的研究报道较少[13]。青蒿作为一种常见的植物，从青蒿中提取的青蒿素可以用来治疗疟疾，因此具有极高的药用价值[14]。这4种提取物据报道均含有多糖2.48%～17.12%、黄酮类2.54%～16.40%、多酚类2.39%～6.56%、氨基酸1.00%～3.21%等物质[15-19]，并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗过敏等多种生物活性及药理作用。

因此本研究将分心木、赶黄草、代代花、青蒿4种可食用植物及其副产物进行提取，通过DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、铁离子抗氧化能力法3种体外抗氧化能力测试，对4种植物提取物的抗氧化能力进行评价，并将所得到结果与各植物提取物的总黄酮和总酚含量建立联系，以期为天然产物的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赶黄草（Penthorum chinense Pursh）：四川省古蔺县桂花乡臣相赶黄草种植专业合作社；分心木（Diaphragma juglandis Fructus）、代代花（Citrus aurantium L.）：中国北京同仁堂（集团）有限责任公司；青蒿（Artemisia annua L.）水提取物：长沙中仁生物科技有限公司。

总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒（ferric reducing ability of plasma，FRAP微板法）：上海源叶生物科技有限公司；芦丁和亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠（分析纯）：西安化学试剂厂；2，2-二苯基-1 苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基清除能力检测试剂盒 、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6磺酸）[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]自由基清除能力检测试剂盒、没食子酸、福林-酚（Folin-Ciocaileu）试剂（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

精密电子天平（AL-104型）：上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；粉碎机（BJ-300A型）：德清拜杰电器有限公司；数控超声波清洗器（KH5200DE型）：昆山禾创超声仪器有限公司；旋转蒸发仪（RV 10D S96型）：广州仪科实验室技术有限公司；冷冻干燥机（FDU-2110型）：东京理化器械株式会社；酶标仪（FLEXA-200型）：杭州奥盛仪器有限公司；恒温水浴锅（HH.S21-8型）：上海博迅实业有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9030B型）：上海森信实验仪器有限公司；超纯水制备仪（EPED-EZ-10TJ型）：南京易普易达科技发展有限公司；离心机（5425型）：德国艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

赶黄草、分心木、代代花经晾晒干燥，将样品粉碎后过60目筛待用。

1.3.2 植物提取物的制备

分心木的提取参考肖敏等[20]的方法并稍作修改。准确称取粉碎后的分心木粉末40 g，以60%乙醇提取活性成分，料液比为 1∶30（g/mL），53 ℃超声辅助提取55 min，抽滤，残渣反复提取3次。合并滤液后，经旋转蒸发仪浓缩，并冷冻干燥后即可得到约5 g浅棕色粉末即分心木提取物。

赶黄草的提取参考郭建敏等[21]的方法并稍作修改。准备称取粉碎后的赶黄草粉末60 g，以70%乙醇提取活性成分，料液比为 1∶25（g/mL），55 ℃超声辅助提取40 min，抽滤，残渣反复提取3次。合并滤液后，经旋转蒸发仪浓缩，并冷冻干燥后即可得到约6 g浅棕色粉末即赶黄草提取物。

代代花的提取参考郝可欣等[22]的方法并稍作修改。准确称量粉碎后的代代花粉末50 g，以60%乙醇提取活性成分，料液比为 1∶20（g/mL），55 ℃超声辅助提取40 min，抽滤，残渣反复提取3次。合并滤液后，经旋转蒸发仪浓缩，并冷冻干燥后即可得到约5 g棕色粉末即代代花提取物。

青蒿提取物以纯水煮沸回流，按照料液比1∶10（g/mL）提取，经旋转蒸发仪浓缩，并冷冻干燥后即可得到棕黄色粉末即青蒿水提取物。

1.3.3 总黄酮含量的测定

参考《中国药典》[23]的方法，并加以改进。精密称定样品各0.15 g，加入30%乙醇定容至25 mL，超声处理后过滤。精密量取上述滤液2 mL，加水定容至25 mL作为供试品溶液。分别从供试品溶液中取1 mL置于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL摇匀，放置6 min，加NaOH试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，按照紫外可见分光光度法，在500 nm的波长处测定吸光度。

用无水乙醇将于120℃干燥至恒重的芦丁对照品稀释至 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL。按上述方法进行操作，以吸光度为纵坐标（y）、浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。

各提取物的总黄酮含量参考芦丁（rutin，RT）标准曲线用芦丁当量（每克样品中黄酮类化合物相当于芦丁的毫克数，mg RT/g）表示，根据公式（1）计算，每个提取物平行测定3次。

式中：c为标准曲线算得被测液中总黄酮浓度，mg RT/mL；v为各待测样品提取液总体积，mL；k为待测样品提取液稀释倍数；m为提取物粉末质量，g。

1.3.4 多酚含量检测

参考章林[24]的方法，并加以改进。精密称定样品0.2 g加水定容至100 mL为待测液。取0.1 mL待测液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL福林-酚试剂，再加入3 mL浓度为100 g/L的Na2CO3溶液，定容后混匀。然后室温下避光放置反应2 h，在765 nm处测吸光度。

精密吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 没食子酸标准溶液（100 μg/mL）于 10 mL 容量瓶内，加 1.0 mL Folin-Ciocaileu试剂，再加入3 mL浓度为100 g/L的Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀。然后室温下避光放置反应2 h，在765 nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标（y）、浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。

各提取物的总酚含量参考没食子酸（gallic acid，GA）标准曲线用没食子酸当量（每克干样品中酚类化合物相当于没食子酸的毫克数，mg GAE/g）表示，根据公式（2）计算。每个提取物平行测定3次。

式中：c为标准曲线算得被测液中总酚浓度，mg GAE/mL；v为各待测样品提取液总体积，mL；k为待测样品提取液稀释倍数；m为提取物粉末质量，g。

1.3.5 DPPH自由基清除能力检测

将4种植物提取物以纯水为溶剂，配制成一定浓度的样品，10 000 r/min室温离心3 min，取上清液作为待测液。将DPPH母液与无水乙醇按照体积比4∶21的比例配成DPPH工作液。按照DPPH自由基清除能力试剂盒说明书进行加样，混匀后室温避光静置30 min后，测定515 nm处的吸光度。空白孔、对照孔和测定孔的吸光值分别记为A空白、A对照和A测定。DPPH自由基清除率计算公式如下。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力检测

将4种植物提取物以纯水为溶剂，配制成一定浓度的样品，10 000 r/min室温离心3 min，取上清液作为待测液。根据比例配成ABTS工作液。按照ABTS+自由基清除能力试剂盒说明书进行加样，充分混匀后室温避光静置6min后，测定405nm处的吸光度。空白孔、对照孔和测定孔的吸光值分别记为A空白、A对照和A测定。ABTS+自由基清除率计算公式如下。

1.3.7 总抗氧化能力检测（FRAP法）

将4种植物提取物由纯水配制成一定浓度，10 000 r/min室温离心3 min，取上清液。将FRAP缓冲液、氯化三苯四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TPTZ）溶液、氯化铁溶液按照体积比 10∶1∶1 配制FRAP工作液。

标准曲线绘制：用纯水将亚铁标准溶液（10mmol/L）稀释至 0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5 mmol/L。按照T-AOC试剂盒说明书进行加样，置于37℃水浴锅保温30 min后，测定593 nm处吸光度值。以系列Fe2+浓度（mmol/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，作出标准曲线。

准确称取提取物以纯水为溶剂，配制成不同的浓度。按照上述方法进行加样，用酶标仪检测593 nm处吸光度。样品最终的总抗氧化能力以Fe2+的当量浓度（FRAP值）表示。

式中：cFe2+当量为标准曲线算得提取物相对应的Fe2+浓度，mmol/L ；c提取物为提取物浓度，mg/mL。

1.4 数据处理

每组数据平行测定3次，结果用平均值±标准差表示。用SPSS 22.0统计软件分析数的差异显著性和相关性，采用Origin 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 总黄酮、总酚含量检测结果

芦丁的标准曲线的线性拟合方程：y=9.195 0x+0.018 9，R2=0.998 6，在测定范围内，芦丁浓度与吸光度呈良好的线性相关。没食子酸的标准曲线的线性拟合方程：y=0.103 4x+0.018 3，R2=0.998 9，在测定范围内，芦丁浓度与吸光度值呈良好的线性相关。4种植物提取物的总黄酮和总酚的含量，结果见表1。

表1 不同植物提取物中的黄酮和多酚含量Table 1 Contents of flavonoids and polyphenols in different plant extracts

由表1可知，4种植物提取物中分心木提取物的总黄酮含量最高，为（21.87±0.55）mg RT/g，其次是赶黄草提取物，而青蒿和代代花提取物的总黄酮含量最低；赶黄草提取物的总酚含量最高，为（14.78±0.95）mg GAE/g，分心木和代代花提取物总酚含量之间无显著差异，而青蒿提取物的总酚含量最低。

2.2 对DPPH自由基清除作用

DPPH自由基清除率的测试是作为判定样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于天然产物、食品、保健品及药品的抗氧化能力研究[25-26]。4种植物提取物对DPPH自由基的清除作用见图1。

图1 4种植物提取物对DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH free radical sacvenging activities of four plant extracts

由图1可知，在一定浓度范围内，4种植物提取物对DPPH自由基的清除率与浓度成量效关系，DPPH自由基的清除率均随浓度的升高而增大。分心木和赶黄草提取物对DPPH自由基的清除率略低于VC，青蒿和代代花提取物对DPPH自由基清除率明显低于VC，这说明了分心木和赶黄草具有较强的抗氧化能力。

对植物提取物浓度和相应的DPPH自由基清除率进行线性回归分析，并通过回归方程得到了不同提取物清除率的IC50。IC50值越小则说明该物质对自由基的清除率达到50%时所需要的物质浓度越小，对DPPH自由基的清除能力强，反之则说明对DPPH自由基的清除能力弱[27]。根据线性回归方程可计算出各提取物的IC50值分别为分心木（38.85 μg/mL）、赶黄草（45.88 μg/mL）、青蒿（397.50 μg/mL）、代代花（634.23 μg/mL）。4 种提取物DPPH自由基清除能力的大小顺序为分心木＞赶黄草＞青蒿＞代代花。

2.3 对ABTS+自由基清除作用

ABTS法可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定，是使用最广泛的间接检测方法[28]。4种植物提取物对ABTS+自由基的清除作用见图2。

由图2可知，4种植物提取物对ABTS+自由基的清除率与浓度成量效关系，在一定浓度范围内，浓度越大对ABTS+自由基的清除率越大。4植物提取物对ABTS+由基清除率均小于VC，但也表明了4种植物提取物均具有一定的抗氧化活性。

图2 4种植物提取物对ABTS+自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of four plant extracts on ABTS+free radical

各提取物的IC50值，分别为赶黄草0.81 mg/mL、分心木1.41 mg/mL、青蒿2.16 mg/mL、代代花4.03 mg/mL，4种提取物ABTS+自由基清除能力的顺序为赶黄草＞分心木＞青蒿＞代代花。

2.4 总抗氧化能力

FRAP法是一种通过铁离子还原反应的能力来测定总抗氧化能力的方法[29]。总抗氧化能力标准曲线的线性拟合方程：y=1.648 3x+0.141 3，R2=0.995，线性关系良好。4种植物提取物的总抗氧化能力见图3。

图3 4种植物提取物的总抗氧化能力Fig.3 Total antioxidative capacities of four plant extracts

由图3可知，4种植物提取物的总抗氧化能力大小顺序为分心木[（3.12±0.14）mmol/g]＞赶黄草[（2.74±0.18）mmol/g]＞青蒿[（0.45±0.01）mmol/g]＞代代花[（0.42±0.03）mmol/g]，与对DPPH自由基清除能力的IC50值保持一致。

2.5 相关性分析

植物提取物抗氧化机制在于清除自由基、降低氧化中间体、抑制酶促氧化等，其抗氧化能力的大小又多与总和总黄酮含量呈正相关[30-31]。一般来说多酚或黄酮含量越高，化合物抗氧化能力越强[32]。

采用SPSS17.0软件对4种不同提取物中总黄酮含量、总多酚含量及抗氧化活性进行了Person法相关性分析，结果见表2。

表2 4种植物提取物总酚、总黄酮与抗氧化能力的相关性分析Table 2 The relationships of the contents of total polyphenols and total flavonoids with the antioxidant activity of four plant extracts

由表2可知，总黄酮含量与DPPH自由基清除能力、总抗氧化能力呈显著性相关，总酚含量与各抗氧化能力相关性不显著。由此可见，4种植物提取物的抗氧化能力与总黄酮的含量排序基本保持一致。根据抗氧化能力与总黄酮含量的显著相关性可以推测，以2-苯基色原酮所具有的母核的黄酮类化合物所形成的交叉共轭体系，在植物提取物的抗氧化综合能力的大小比较中占主要因素[33]。

3 结论

对4种植物提取物的总酚、总黄酮含量进行测定，同时以DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、总抗氧化能力为指标，研究了4种植物提取物的抗氧化能力。结果表明，4种植物提取物均含有丰富的总黄酮和总酚。4种提取物中分心木提取物的总黄酮的含量最高，为（21.87±0.55）mg RT/g。赶黄草提取物的总酚含量最高，为（14.78±0.95）mg GAE/g。4种植物提取物中分心木的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力最强，IC50值和 FRAP值分别为 8.85 μg/mL和（3.12±0.14）mmol/g。赶黄草的ABTS+自由基清除能力最强，IC50值达到0.81 mg/mL。因此，分心木和赶黄草的综合抗氧化能力大于青蒿和代代花。在总黄酮和总酚含量与抗氧化能力的相关性分析中，总黄酮含量和抗氧化能力呈正相关，说明对于这4种植物来说，黄酮类化合物的抗氧化作用占主导地位。