姜黄素对脓毒症模型小鼠肺损伤的作用及作用机制*

2022-12-20王文军

中国药业 2022年23期

王文军，汪琳

（1. 电子科技大学医学院附属绵阳医院·四川省绵阳市中心医院，四川绵阳 621000； 2. 中国海关科学技术研究中心，北京 100004）

脓毒症是一种由感染引起的全身性炎性反应综合征，病情发展迅速，治疗难度大，致死率高［1］。器官损伤和衰竭是脓毒症的典型特征，肺是脓毒症病程中受影响最大的器官［2］，25%～50%的脓毒症患者会引发急性肺损伤［3］，死亡率为40%［4］。研究表明，脓毒症的发病机制涉及复杂的全身炎性反应，与炎性因子过度表达、凝血功能、氧化反应和免疫功能紊乱有关，但目前尚无治疗脓毒症及其并发症的有效方案［5］。氧化应激参与脓毒症病程［6］，姜黄素是从姜黄药材中提取的活性成分，具有抗炎、抗氧化和免疫调节作用，利用酚羟基捕捉自由基，对肝损伤和氧化损伤起保护作用。本研究中探讨了具有抗氧化特性的姜黄素治疗脓毒症模型小鼠肺损伤的作用及作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：Midi40 型二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；Synergy4 型多功能酶标仪，ChemiDocTM 型成像系统，CFX ConnectTM Real - time System 型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪，均购于美国 Bio - Rad 公司；Centrifuge 5424R 型离心机（德国Eppendorf 公司）；ER-180A 型电子天平（日本A&D 公司，精度为0.001 g）。

试药：姜黄素（批号为C1386，纯度>98%），伊文思蓝，甲酰胺，二甲基亚砜（DMSO），磷酸盐缓冲液（PBS，批号为 806544），均购于美国 Sigma 公司；RIPA 裂解液，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析试剂盒，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配胶试剂盒，增强型化学发光（ECL）试验试剂盒，肿瘤坏死因子-α（TNF - α）、白细胞介素 1β（IL - 1β）、白细胞介素 6（IL - 6）酶联免疫吸附（ELISA）试验试剂盒，均购于美国Thermo Fisher Scientific 公司；逆转录试剂盒、Trizol试剂盒（美国Promega 公司）；核因子类胡萝卜素衍生2 样因子（Nrf2）抗体（批号为ab137550），血红素加氧酶1（HO -1）抗体（批号为ab13248），均购于美国Abcam 公司；磷酸脱氢酶（GAPDH，美国CST 公司，批号为5174s）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血浆尿素氮（BUN）肝肾功能指标检测试剂盒（美国BioAssay Systems公司，货号分别为EALT-100，EASTR-100，DIUR-100）。

动物：清洁级BALB/ c 小鼠48 只，雌雄各半，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，10～12 周龄，体质量22～25 g。术前12 h禁食。

1.2 方法

分组、建模与给药：48 只小鼠随机分为假手术组（7只）、手术组（17只）、假手术+姜黄素组（7只）、手术+姜黄素组（17只）。采用盲肠结扎穿刺（CLP）法构建脓毒症模型小鼠，小鼠腹腔注射水合氯醛（60 μL/ 10 g）麻醉，剃去腹壁毛发，用碘消毒，前腹正中切口3 cm，取出盲肠，用6.0 丝线在距离盲端1.5 cm 处结扎，用22 号针头在结扎处远端穿孔1 次，挤出少许粪便，再将盲肠纳入腹腔，逐层关腹。术后立即皮下注射0.9%氯化钠注射液24 mL/kg，防止体液丢失过多。假手术组除以结扎及针头对穿盲肠外，其他步骤与CLP 法一致。假手术组和手术组小鼠术后2 h 腹腔注射0.1%DMSO，假手术+姜黄素组和手术+姜黄素组术后2 h腹腔注射200 mg/kg姜黄素（用0.1%DMSO稀释）。

生存率观察：术后每天统计小鼠生存情况，术后7 d仍存活为生存，比较各组的生存率。

肝肾功能指标及炎性因子水平检测：术后24 h，各组小鼠麻醉后开腹，立即于下腔静脉采全血100～400 μL，转移至含乙二胺四乙酸的试管中，以10 000 r/min的转速分离血浆，-80 ℃保存，备用。采用肝肾功能指标检测试剂盒检测血浆中ALT，AST，BUN 的水平，采用ELISA试验试剂盒检测血浆中 TNF - α，IL - 1β，IL - 6 的水平，按试剂盒说明书操作。

肺湿干重比（W/D）计算：精密称定未灌洗的新鲜左肺组织的质量，即湿重（W）；再置60 ℃恒温烤箱48 h至恒温，称定质量，即干重（D）。计算W/D。

肺微血管渗透性检测：小鼠处死前40 min，经尾静脉注射100 μL 1%伊文思蓝溶液50 mg/ kg，处死小鼠后暴露胸腔，用PBS 灌洗肺血管至左心房无血性液体流出，收集肺组织，称定质量并记录，再加入1 mL 甲酰胺，置60 ℃恒温烤箱内孵育16 h，取出，以2 000 r/min的转速离心10 min，吸取上清液，采用酶标仪于620 nm波长处测定吸光度。肺微血管渗透性，以伊文思蓝渗漏指数表示，按公式伊文思蓝渗漏指数= 肺组织伊文思蓝含量/肺湿重计算。

肺组织核糖核酸（RNA）的提取和实时荧光定量PCR：用Trizol 试剂提取肺组织中总RNA，参照逆转录试剂盒说明书操作。采用实时荧光定量PCR 仪检测获得的互补基因（cDNA），总体积为20 μL。循环PCR 扩增标准程序，95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环，延伸阶段收集荧光信号，循环结束后分析溶解曲线。每例样品设3 个平行复孔，重复3 次，取平均值，收集检测数据，测定各样品的Ct值，计算目的基因的相对表达量为2-ΔΔCt。以持家基因GAPDH 为内参，退火温度均为60 ℃，基因TNF- α，IL-6，IL-1β，GAPDH的相应引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR所用引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

免疫印迹（Western blot）法检测：收集各组小鼠肺组织蛋白，并加入适量蛋白裂解液，剪碎，超声处理，冷冻，离心（转速为12 000 r/ min）10 min，吸取上清液进行BCA 蛋白定量分析。以12%SDS-PAGE 分离蛋白样品，低电压（100 V）转移1.5 h 至硝酸纤维素膜，预染蛋白质分子量标准标识蛋白位置。用5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，含 5%BSA 的 TBST 稀释一抗，4 ℃过夜，TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，二抗室温孵育 1 h，洗膜 3 次，每次5 min，ECL液显色。

1.3 统计学处理

采用Image J 1.53a 版软件计算Western blot 灰度值，采用Graphpad Prism 9.0软件作图及分析。计量资料用表示，计数资料用率（%）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 存活率

术后7 d，假手术组和假手术+姜黄素组小鼠的存活率均为100.00%（7/ 7）；手术组小鼠存活率为29.41%（5/17），术后48 h 达到1 d 死亡最高峰；手术 +姜黄素组小鼠存活率为64.71%（11/ 17），显著高于手术组的29.41%（P<0.05）。详见图1。

图1 各组小鼠术后7 d存活率Fig.1 Survival rates within 7 d after the surgery in each group

2.2 相关器官损伤

由表2 可知，与假手术组比较，手术组小鼠的ALT，AST，BUN 水平、肺组织W/D、肺微血管渗透性均显著升高（P< 0.05）；与手术组比较，手术+ 姜黄素组小鼠的ALT，AST，BUN 水平、肺微血管渗透性、肺组织W/D均显著降低（P<0.05），假手术组小鼠是否给予姜黄素并不改变肺组织微血管的渗透性。

表2 各组小鼠肝肾功能指标、伊文思蓝渗漏指数与肺组织湿干重比比较（）Tab.2 Comparison of liver and kidney function indexes，leakage index by the Evans blue dye assay and W/D of lung issue in each group（）

注：与假手术组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与手术组比较，#P < 0.05。表3和图2同。Note：Compared with those in the sham surgery group，*P < 0.05，**P < 0.01；Compared with those in the surgery group，#P < 0.05（for Tab.2-3 and Fig.2）.

组别W/D 2.83±0.16 5.49±0.38**2.86±0.30 4.01±0.23#假手术组（n=7）手术组（n=17）假手术+姜黄素组（n=7）手术+姜黄素组（n=17）ALT（U/L）13.65±0.24 44.04±7.25*13.32±0.29 22.51±2.04#AST（U/L）17.69±3.53 57.35±5.19*15.77±1.91 36.40±4.36#BUN（U/L）36.69±0.92 93.01±7.83*33.03±3.09 62.28±5.25#伊文思蓝渗漏指数（ng/mg）13.43±1.57 31.22±3.98*17.51±1.78 20.57±1.89#

2.3 小鼠血浆炎性因子水平

与假手术组比较，假手术+ 姜黄素组小鼠血浆中TNF- α，IL-6，IL-1β 水平均无显著差异（P>0.05），手术组小鼠血浆中TNF- α，IL-6，IL-1β 的水平均显著升高（P< 0.05）；与假手术+ 姜黄素组比较，手术+姜黄素组小鼠血浆中TNF- α，IL-6，IL-1β 的水平均显著升高（P< 0.05）；与手术组比较，手术+ 姜黄素组小鼠血浆中TNF- α，IL-6，IL-1β 的表达水平均显著降低（P< 0.05）。详见表3。可见，姜黄素可减轻CLP 导致脓毒症模型小鼠的早期全身炎性反应。

表3 各组小鼠血浆中炎性因子水平比较（，pg/mL）Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels in plasma in each group（，pg/mL）

注：与假手术 + 姜黄素组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01。图2同。Note：Compared with those in the sham surgery + curcumin group，△P < 0.05，△△P < 0.01（for Tab.3 and Fig.2）.

IL-1β 15.60±2.09 34.62±1.76*14.19±0.83 22.46±1.42#△组别假手术组（n=7）手术组（n=17）假手术+姜黄素组（n=7）手术+姜黄素组（n=17）TNF-α 12.14±1.46 70.30±10.55*11.81±0.55 40.30±4.94#△IL-6 14.25±4.91 43.64±11.35*13.99±5.63 17.00±3.28#△

2.4 肺组织损伤

提取肺组织RNA，采用实时荧光定量PCR 仪检测TNF - α，IL - 6，IL - 1β 在 mRNA 中的表达水平，结果见图2 A。与假手术组比较，手术组小鼠肺组织中TNF-α，IL - 6，IL - 1β 在 mRNA 中的表达水平分别上升了3.6 倍、3.6倍、5.4倍，差异显著（P<0.05）；与手术组比较，手术+姜黄素组小鼠肺组织中TNF-α，IL-6，IL-1β在mRNA中的表达水平分别降低了1.4倍、1.7倍、2.0倍，差异显著（P< 0.05）。可见，姜黄素可减轻肺组织中的炎性反应。采用Western blot 法检测小鼠肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平，结果见图2 B至图2 D。与假手术组比较，假手术+ 姜黄素组小鼠肺组织中Nrf2和HO-1的表达水平均无显著差异（P>0.05），手术组小鼠肺组织中Nrf2 和HO - 1 的表达水平均显著升高（P< 0.05）；与手术组比较，手术+ 姜黄素组小鼠肺组织中Nrf2和HO-1的表达水平均显著升高（P<0.05）；与假手术+ 姜黄素组比较，手术+ 姜黄素组小鼠肺组织中Nrf2和HO-1表达水平均显著升高（P<0.01）。

图2 姜黄素对小鼠肺组织中炎性因子和Nrf2/HO-1表达水平的影响Fig.2 Effect of curcumin on the expression levels of inflammatory factors and Nrf2/HO-1 in lung tissue of mice

3 讨论

脓毒症是重症监护室患者最常见的死亡原因［7］。姜黄素是从姜科植物根茎中提取的天然多酚类化合物，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等作用［8］。LIN［9］采用内毒素或细菌注射构建脓毒症动物模型，发现姜黄素治疗脓毒症有效。本研究中首先观察姜黄素对CLP诱导脓毒症模型小鼠生存率的影响，结果显示，姜黄素可改善脓毒症模型小鼠术后7 d的存活率（尤其是在术后48 h），手术组小鼠的死亡率显著高于手术+姜黄素组，提示用姜黄素及早干预治疗脓毒症对提高生存率有重要作用。而脓毒症患者肺损伤和肾损伤的早期发现对后续治疗和预后尤其重要，ALT，AST，BUN等指标可提示肝、肾功能损伤［10］。本研究结果显示，手术+姜黄素组小鼠术后24 h血浆中肝、肾功能的损伤减轻，肺W/D 显著降低，尤其是肺微血管渗透性显著降低，表明姜黄素可减轻早期脓毒症肺及肝、肾功能的损伤，从而降低死亡率。

脓毒症主要发生于严重感染或术后并发症［1］，引起的肝功能损伤与炎性因子的过度产生、氧自由基损伤、氧供需失衡等因素有关［2］，故调控以上因素可减轻脓毒症的肝功能损伤。IL-6 是继TNF- α 和IL-1β 后在脓毒症早期发病过程中起关键作用的炎性因子，可直接激活血管内皮细胞及炎性细胞，并诱导上皮细胞及其他细胞，从而增强炎性反应。本研究结果显示，CLP手术诱导的早期脓毒症模型小鼠血浆中TNF - α，IL - 6，IL - 1β 等炎性因子水平均显著升高，表明早期抑制脓毒症的肝细胞炎性反应可减轻脓毒症的肝功能损伤。姜黄素抗炎作用显著，可抑制炎性因子表达，减轻重症急性胰腺炎模型大鼠的肾功能损伤［11］。研究发现，在香烟提取物处理的RAW246.7 细胞中，姜黄素可抑制核因子 - κB（NF - κB）信号通路，减少促炎因子的释放［12］。本研究结果显示，CLP 手术诱导的脓毒症模型小鼠术后用姜黄素治疗，血浆中TNF - α，IL - 6，IL - 1β的表达水平均显著降低，肺组织中相关炎性因子的分泌也显著减少，改善CLP 手术诱导的小鼠肺损伤的效果显著。氧化应激是导致脓毒症肺损伤发展的主要因素，抑制氧化应激可减轻脓毒症的肺损伤［13］，故认为增强抗氧化能力可减少氧化应激，是对抗脓毒症肺损伤的有效治疗方法。Nrf2是一种具有强效抗氧化特性的蛋白质［14］，通过直接注射Nrf2 腺病毒或间接干预（如缺血后处理）激活Nrf2，可减少多种疾病模型老鼠中的肺损伤［15-16］。可见，Nrf2的激活在减缓肺损伤过程中起关键作用。本研究结果显示，与假手术组比较，手术组小鼠肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平均显著升高，而用姜黄素治疗可进一步增加肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平。故认为姜黄素是通过激活Nrf2/HO-1信号通路来增强抗氧化能力而减轻脓毒症肺损伤的。

综上所述，在脓毒症的早期治疗中，姜黄素可通过Nrf2/ HO - 1 信号通路抑制炎性反应和增强抗氧化能力，从而减轻脓毒症模型小鼠的肺损伤，其可能是治疗脓毒症的潜在有效药物。