活细胞转录组测序技术 微创提取即可看清细胞“前世今生”

文／刁雯蕙 刘传书

细胞是生命的基本单位，了解它的过去、现在和未来不仅有助于我们了解正常的发育过程，也对理解疾病的产生和发展至关重要。然而，想要看清细胞的“前世今生”仍然面临很大的技术困难。

8月17日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所研究员陈万泽以共同第一作者身份在国际顶级期刊《自然》杂志上发表长文，介绍了他们研究团队在国际首创的活细胞转录组测序技术（Live-seq），该技术首次让单细胞进行转录测序后，依然能保持细胞存活，首次实现了活细胞全基因表达的连续观测。

“该研究实现了使用活细胞转录组测序技术对同一个活细胞多次分离部分细胞质进行多次转录组测序，表明这一技术有望在将来用于构建单个活细胞的转录组系列变化动态模型。该研究为单细胞转录组测序提供了全新的研究策略，为我们理解生命过程的动态变化提供了强有力的手段，是这一领域的又一重大突破。”北京大学生命科学学院教授汤富酬评论道。

不杀死细胞就能进行测序

为什么人类体内的细胞拥有的基因组几乎一样，但是每个人却各不相同呢？基因组中数万个基因表达与否和表达程度高低，很大程度上决定了细胞的种类和功能。

因此，如果知道细胞不同时间的基因表达的变化，就能够了解细胞的过去、现在和未来。

当前，单细胞转录组测序技术是了解细胞状态的重要手段，通过单细胞转录组测序能够看清细胞现在所有基因的表达状态。但是该技术在理解细胞的动态变化方面却面临很大挑战。

“利用单细胞转录组测序技术来观测细胞状态的前提，是需要将细胞裂解，提取其中的RNA来测定每个基因表达量的高低，但这样就不可避免地杀死了细胞。”陈万泽说道，“使用单细胞转录组测序技术，也只能了解到一个细胞当下的状态，却不能了解它的过去，也无法知晓它将来的功能。”

通过近7年的努力，陈万泽与合作者开发了活细胞转录组测序技术，其核心是通过对活细胞中的部分细胞质进行微创提取，并对极其微量的细胞质RNA进行扩增，实现在进行单细胞转录组测序后，依旧保持细胞的存活和功能，从而可以跟踪细胞的动态变化。

论文通讯作者、瑞士洛桑联邦理工学院教授巴特·普朗克（Bart Deplancke）表示，该技术兼具全基因表达分辨率和动态解析能力，是目前对单细胞转录组直接动态测量、偶联细胞现有状态和其后续表型的唯一解决方案。

历经两次碰壁终于“吸”出RNA

如何在不杀死细胞的前提下，看到细胞的动态变化？

“我们首先想到的是外泌体，它是细胞向外面吐出来的小泡，里面有蛋白质、RNA等物质。如果我们把单个细胞的外泌体都收集起来，再对其中的RNA进行测量，或许就可以在一定程度上反映细胞状态而又不杀死细胞。”陈万泽说道。

单个细胞中仅有10皮克的RNA，这相当于一克的一千亿分之一的重量，而细胞分泌的外泌体中的RNA更是少之又少。研究团队设计了一种微流控技术用以完成单细胞捕获、外泌体收集等，但他们发现由于外泌体中的RNA数量太少，根本无法实现单细胞分子水平的观测。

随后，陈万泽尝试利用在生命科学领域非常小众的原子力显微镜来获取细胞中的RNA。它有一个很尖的硅探针，多用来检测物质表面性质。研究团队通过对探针进行表面活化、修饰、洗脱等改造，让其能够把细胞中的RNA“钓”出来。

“这种探针很细，对细胞的损伤很小，就像鱼钩一样，改造后可以把细胞中的RNA‘钓’出来，并能保证细胞继续存活。我们改造了数十个探针后，结果只在两个细胞上成功‘钓’到了RNA。”陈万泽回忆道，当时购买一个原子力显微镜探针需要800美元，研究成本太高，成功率太低，这种情况让这项研究再次面临阻碍。

在一次偶然的学术交流中，陈万泽与导师了解到，瑞士苏黎世联邦理工学院的朱丽亚·沃尔特（Julia Vorholt）实验室开发了一种特殊的原子力显微镜，能够吸出一部分细胞质。

一番交流后，陈万泽团队与朱丽亚·沃尔特实验室一拍即合，展开了联合攻关。联合团队对一系列的实验过程进行了优化，解决了RNA降解、低温下的快速操作、超微量样品转移、采样通道清洗避免交叉污染、图像下追踪细胞等多个问题，保证了实验结果的可靠性。

联合团队利用重新改造后的活细胞转录组测序技术，对5种类型共295个细胞进行了测序，发现该技术能够有效区分不同类型的细胞，且平均每个细胞能检测到约4112个基因的表达信息。

仅对少量的细胞质进行测序，是否就能代表细胞的状态？

“我们平行比较了单细胞转录组测序结果，发现活细胞转录组测序结果与普通的单细胞转录组测序结果高度吻合，证明活细胞转录组测序技术能够很好地体现细胞的全转录组状态。”陈万泽说道。

细胞的存活率又如何保证呢？

“这种特殊的原子力显微镜探针尖端只有几百个纳米大小，对细胞损伤极小。吸取约5%—50%的细胞质后，细胞体积可以快速恢复到正常水平，存活率为85%—89%，细胞能进行正常分裂。通过一系列的功能分析和分子表征，我们没有发现活细胞转录组测序技术对细胞的状态有显著的影响。”陈万泽表示。

对此，审稿人在评审意见中也写道：“由于细胞测序后仍旧存活，活细胞转录组测序技术首次实现了对同一个细胞全基因表达的连续测量。”

细胞测序结果从“高清图片”到“高清电影”

在细胞观测技术史上，显微成像和基因编辑介导的分子记录等技术不仅能观察细胞的生长、分裂、死亡等过程，还能观测细胞中的单个或几个基因指标。

2009年，单细胞转录组测序技术为更系统全面地定义细胞类型和状态提供了变革性手段。但人们仍然只能观察到细胞的静态状态，无法连续观测细胞的动态或者检查细胞后续的表型。

如果将利用单细胞转录组测序技术观测细胞，比喻为看一张细胞在分子水平的高清图片，那么利用活细胞转录组测序技术观测细胞，就好比看一部细胞的高清电影，能够看见它的“前世今生”。

“活细胞转录组测序技术可以回答细胞怎样的过去决定了它的现在，不仅知道细胞为何存在差异，还知道这些差异从何而来。”陈万泽介绍。

在验证实验中，研究团队利用活细胞转录组测序技术直接测定了同一个巨噬细胞在不同时间的状态变化，发现细胞起始状态的少数基因的表达差异和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是决定细胞后续反应差异的重要原因。然而，普通的单细胞转录组测序技术无法找到这些规律。

陈万泽表示，尽管活细胞转录组测序技术仍然存在诸多挑战，需要进一步完善，比如低通量、暂不能在体内应用、在高度极化且mRNA分布不均的细胞中无法实现全细胞转录组测序、对细胞更多次的采样还需进一步研究等，但该技术首次实现了活细胞连续观测，也为单细胞测序技术发展带来了更多可能性。未来，团队将进一步进行深入研究，提高活细胞转录组测序技术的可用性。