线粒体Higd 1a在新生儿缺氧缺血性脑损伤中的研究进展*

叶超群 黄会芝

缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生儿期常见的严重神经系统疾病，无论是足月儿还是早产儿，都有较高的死亡率；此外，HIBD 也是儿童严重神经残疾的主要原因。每年，全世界1.3 亿新生儿中有400 万婴儿患有HIBD，其中有100 万人死于脑损伤，存活下来的HIBD 婴儿通常会遗留智力低下、脑瘫、癫痫和其他功能障碍，严重影响了患儿的生活质量。这无论是对于患儿家庭还是社会而言，都是严重的创伤[1-2]。然而，HIBD 发病机制尚未完全明确，亚低温是目前唯一公认有效的治疗方案，但对于中重度脑损伤患儿的疗效有限，仍有相当一部分患儿死亡或存在各种形式的后遗症[3-5]，因此迫切需要新的治疗策略。

缺氧诱导基因结构域蛋白-1a（hypoxia inducible gene domain family 1a，Higd 1a）又称为HIG1 或HIMP1-a（hypoglycemia/hypoxia inducible mitochondrial protein 1）是一种存在于多种类型细胞线粒体的内膜蛋白，在真核生物中广泛表达，包括真菌和人类。Higd 1a 最初在人工培养的人宫颈上皮细胞中被发现，遂被证明可以在富含神经元的原代培养基中被低氧诱导及在小鼠胚胎成纤维细胞中被镍诱导[6-7]。近年来发现其在脑、心脏、结肠、肾和肝脏等组织中普遍表达，而在小鼠的小脑、额叶和皮质中表达水平尤为明显。Higd 1a 由93 个氨基酸组成，分子量为10.6 kDa，等电点为9.8，基因定位于8 号染色体8q32，基因库序列编码AY062253，基因序列全长527 bp。Higd 1a 具有两个跨膜区，它的两个选择性剪接产物（HIMP1-a 和HIMP1b）各自形成一个跨膜环，“U”形穿过线粒体内膜，并具有“N 端-C 端”方向，其N 端和C 端位于线粒体内膜外侧。Higd 1a 受缺氧诱导因子-1（HIF-1）调控，主要由缺氧和低糖诱导表达，参与应激反应中的抗凋亡过程，并与微环境应激条件有关，其中也以缺氧最为多见。据报道，Higd 1a 具有调节线粒体内环境稳态功能，进而参与调节多种细胞内功能，如能量的产生、维持氧化还原稳态及钙稳态、抗细胞凋亡等[8-9]。Higd 1a 在低氧条件下的抗细胞凋亡作用为新生儿缺氧缺血性脑病的治疗提供了新的方向，故本文主要综述Higd 1a 在新生儿缺氧缺血性脑损伤中的分子机制及Higd 1a 在缺氧缺血中的作用，并为Higd 1a 在新生儿缺氧缺血性脑损伤中的应用提供更有力的证据，为进一步探索脑缺氧缺血性损伤的治疗提供新的靶向治疗方案。

1 线粒体Higd 1a在缺氧缺血性脑损伤中的分子机制

缺氧缺血性脑损伤的具体机制尚不完全明确，兴奋毒性、氧化应激、炎症和细胞凋亡机制共同参与并最终导致脑损伤，线粒体损伤则贯穿整个损伤过程，并成为新生儿缺氧应激后的神经退行性变中的关键阶段，与随后诱导细胞死亡通路有关，是缺氧缺血损伤的关键标志[10-11]。当缺氧缺血时，脑细胞线粒体在缺氧早期即发生一系列不可逆性损伤，脑作为体内代谢最活跃的器官之一，较容易受到血氧供应不足的损害[12]。脑缺氧缺血发生后，脑内葡萄糖、糖原、三磷酸腺苷（ATP）和磷酸肌酸的浓度立即下降，并在缺血后10～12 min 几乎完全耗尽。根据动物模型的缺氧缺血状态的研究已证实，在缺氧缺血开始后的几分钟内即已出现不可逆的神经元损伤[13]。线粒体的结构、功能异常与脑缺氧缺血损伤的发生、发展关系密切，线粒体的损伤程度同时也提示了缺氧缺血性脑损伤的严重程度[14]。在缺氧缺血等应激条件下，脑细胞对能量的需求尤为明显，而线粒体作为细胞能量代谢的中心，在脑细胞缺氧缺血损伤的过程中发挥着至关重要的影响，故而线粒体成为神经保护的主要目标[15]。有研究发现，Higd 1a 可以保护细胞免受低血糖和低氧诱导的细胞凋亡，延长细胞的存活时间，这提示Higd 1a 在线粒体应激保护中发挥重要作用[16]，Higd 1a 的高表达则提示了脑损伤的良好预后。

线粒体是细胞生物氧化和能量转换的主要场所，为机体提供95%以上的能量，对维持细胞正常生理功能起着重要作用。然而线粒体却是对损伤极为敏感的细胞器，其肿胀可由多种损伤因子引起，其中最常见的即为缺氧。Higd 1a 的表达是由缺氧诱导因子1（HIF-1）诱导，Higd 1a 可能在线粒体呼吸链中发挥多效性作用。暴露在18%和5%氧气中的细胞之间的Higd 1a 蛋白水平没有显著差异，但在缺氧早期，Higd 1a 蛋白水平升高。可见线粒体Higd 1a 在脑缺氧缺血性损伤中的作用主要与氧化呼吸链有关，包括正向调节细胞色素C 氧化酶的产生及抑制氧气消耗，降低细胞活性氧水平。近年来有研究发现中视神经萎缩相关蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）、γ 分泌酶复合体与Higd 1a 在缺氧条件下的表达相关，可能成为Higd 1a 在脑缺氧缺血性损伤中不可缺少的部分。

1.1 Higd 1a 与细胞色素C 氧化酶 细胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，CcO）是线粒体电子传递系统的末端成分，同时也是呼吸电子传递链的第四个中心酶复合物，因此又被称为复合物Ⅳ（complex Ⅳ），是细胞耗氧的主要部位，也是以ATP的化学形式产生有氧能量所必需的[17]。一方面，Higd 1a 参与复合体Ⅳ的组装，以形成呼吸超复合体[18]。另一方面，细胞色素C 与Higd 1a 结合，使血红蛋白的亲和力下降，由于CcO 是体内唯一一种可以利用氧气进行能量传递的酶，因此也有研究认为CcO 的调节机制依赖于氧浓度[19]。Hayashi 等[20]在寻找一种由低氧驱动的CcO 调节因子的过程中发现Higd 1a 是CcO 的正调控因子，通过纯化外源性Higd 1a 蛋白，建立ATP 敏感的荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）探针检测内源性Higd 1a 蛋白的表达量，证明了通过内源性诱导Higd 1a 的表达及外源性增加Higd 1a 蛋白都可提高CcO 的表达量。该研究发现在Higd 1a 缺氧早期被瞬时诱导，直接连接并整合到CcO 大分子复合体中，并使CcO 的活性中心—血红素a 的结构变化，进而调节氧化磷酸化过程，使ATP 的产生增加，从而保护细胞免受缺氧的影响。Higd 1a 是CcO的一个先前未知的调节成分，并且代表着与CcO 活性降低相关的疾病的治疗靶点，为细胞的缺氧缺血性损伤提供新的治疗方向。

1.2 Higd 1a 与活性氧（ROS）线粒体的关键功能是产生ATP，并作为细胞中的能量发生器，它们在需要高浓度ATP 的大脑和心脏组织中尤其重要。然而，高水平的ROS 是高ATP 产生的副产品。Li 等[21]研究发现在线粒体损伤时，高水平的ROS 可以通过上调PGC-1a 和HIF-1a 的表达来诱导Higd 1a 的表达，并通过帮助维持正常的线粒体功能来保护细胞免受缺氧的影响。另一方面，Higd 1a 基因敲除实验表明，即使在常氧条件下，Higd 1a 缺失也会增加活性氧的产生，并损害线粒体的跨膜电位，诱导细胞凋亡。Guo 等[22]证明了在猪的支持细胞中，过表达的Higd 1a 可抑制ROS 的水平。此外，在缺氧和缺血期间，ROS 的大量产生与脑损伤之间有直接关系，而且与其他器官相比，Higd 1a 在大脑和心脏中的表达水平非常高。这表明Higd 1a 可能会抑制这些脑组织中过量的ROS 产生，并保护它们免受氧化应激的伤害。

1.3 Higd 1a 与OPA1 OPA1 基因属于核基因，编码的蛋白是线粒体内源发动蛋白，是线粒体塑形蛋白家族的成员。OPA1 蛋白有L 和S 两种亚型，参与线粒体内膜融合，对线粒体形态结构有着重要的作用。OPA1 与呼吸作用复合物直接相关，作为呼吸链的一部分，保持呼吸链的完整性，参与呼吸作用和能量代谢，在细胞凋亡过程中则与早老素相关菱形样（presenilin associated rhomboid like，PARL）蛋白以OPA1-PARL 复合体的形式发挥抗凋亡因子的作用。

An 等[23]实验证明，Higd 1a 的N 端与OPA1 结合，进而保护OPA1 L 亚型免受诱导切割；Higd 1a沉默则导致L 亚型丢失，继而线粒体脊裂解，线粒体DNA 丢失，细胞生长迟缓；然而，在细胞处于低氧条件（0.1%O2）下12 h，Higd 1a 过表达并延长OPA1 L 亚型的切割时长至6 h。由此可知，在正常条件下，Higd 1a 通过结构性表达保持OPA1 的完整性，而在缺氧条件下，它的过表达虽不能完全阻止OPA1 的切割，但通过推迟OPA1 的切割来缓解细胞压力，维持线粒体完整性，进而帮助细胞抵抗缺氧损伤，这一研究发现为对抗缺氧性损伤提供了新的治疗方向。

1.4 Higd 1a 与γ 分泌酶复合体 γ 分泌酶复合体是由四个亚单位组成的膜内蛋白水解酶，包括早老素（presenilin，PS）包括PS1 和PS2，中前咽缺陷蛋白-1（Aph-1），早老蛋白增强子-2（Pen-2）和Nicastrin，主要参与β-淀粉样蛋白前体（APP）和Notch 蛋白等重要跨膜蛋白的切割和水解过程。Hayashi 等[24]从对γ 分泌酶抑制基因的筛选中分离到Higd 1a，并发现Higd 1a 的过表达可抑制γ 分泌酶活性。Higd 1a 与线粒体膜上的γ 分泌酶成分（PS1、Nicastrin、Aph-1 和Pen-2）直接结合，降低γ-分泌酶活性，从而减少ROS 的产生和线粒体功能障碍，此外，Higd 1a 的缺失增加了γ 分泌酶的激活，增强了缺氧所致的线粒体功能障碍。综上所述，Higd 1a 过表达可使缺氧诱导的线粒体膜γ 分泌酶活性减低并减少细胞内β 淀粉样蛋白的积聚，从而减轻缺氧引起的线粒体功能障碍，故Higd 1a是线粒体γ 分泌酶复合体的一种新的调节剂，并在维持正常线粒体功能方面发挥重要作用，是涉及线粒体损伤性疾病的潜在治疗靶点。

1.5 Higd 1a 与caspase caspase 是一组存在于细胞质中的蛋白酶，与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。为了解缺氧和Higd 1a 过表达是否影响caspases 的激活，An 等[25]将稳定转染Higd 1a 的巨噬细胞（RAW）在缺氧条件下培养6 d，并在指定的时间进行检测，结果发现稳定转染Higd 1a 的巨噬细胞（RAW）在低氧条件下比模型转染细胞存活得更好，而将稳定表达caspase的巨噬细胞在caspase 抑制剂下培养6 d 也明显减少了细胞凋亡。这证明了caspase 活性是由Higd 1a 通过底物和caspase 抑制剂来调节的。降低caspases的活性参与了Higd 1a 细胞在缺氧条件下的存活效应。

2 Higd 1a在缺氧缺血性疾病中的研究前景

Higd 1a 被发现在心脏、脑和肝脏组织中高度表达，在肾脏和骨骼肌中低水平表达[24]。Kurosh 等[26]实验证明，内源性Higd 1a 是体内代谢应激的潜在标记物，常见于不同的病理状态，如心肌梗死、缺氧缺血性脑损伤和不同类型的癌症。可见Higd 1a在缓解缺氧缺血性组织损伤中有充分的理论证据。

外源Higd 1a 可以使低氧条件下斑马鱼线粒体中的呼吸链复合体Ⅳ（C-Ⅳ）的活性增加，CcO 活性增加，同时增加ATP 的合成，提高心脏对于缺氧的耐受性，并发挥器官保护作用。在斑马鱼的缺氧模型中，通过测量线粒体ATP 浓度，可以证明Higd 1a 的组织保护作用。心脏特异性Higd 1a的过度表达缓解了低氧条件下线粒体ATP 的下降，并保护了斑马鱼的心功能[19]。这一结果表明，通过Higd 1a 模拟物可以增加CcO 活性，可能有治疗线粒体疾病的潜力，为缺血性、代谢性和线粒体疾病的治疗提供选择。

Higd 1a 可对抗葡萄糖饥饿并通过减少细胞凋亡来抑制肿瘤生长。Ameri 等[27]研究了Higd 1a 在多种人类癌细胞系中的调控模式，并发现在缺氧缺血最明显的肿瘤坏死区域，代谢应激源触发Higd 1a 的诱导表达，进而抑制肿瘤的生长。另一方面，Higd 1a抑制与乳腺癌治疗后肿瘤复发相关，Higd 1a 抑制与乳腺癌治疗后肿瘤复发相关，Higd 1a 会根据细胞在不同的应激条件下进而产生不同的效应，当严重缺氧的肿瘤细胞面临葡萄糖剥夺时，DNA 甲基转移酶的活性被抑制，促进Higd 1a 表达，对异常代谢环境适应，并诱导肿瘤细胞休眠[28]。这一发现为肿瘤细胞在极端环境的适应机制提供了新的见解，Higd 1a可能在肿瘤休眠或复发机制中发挥重要作用，调节缺氧肿瘤区域Higd 1a 活性可能有助于克服在抗血管生成或HIF 抑制所介导的肿瘤休眠。线粒体蛋白HIGD 家族的小分子调节剂为这一可能性提供了方向[29]。

Higd 1a 在新生儿缺氧缺血性损伤时定位于细胞核。免疫荧光显微镜显示，在对照的新生儿脑中，内源性Higd 1a 主要在细胞核外少量表达；然而在缺氧缺血性脑损伤的新生儿脑内，内源性Higd 1a 的表达水平明显升高[24]。Higd 1a 作为一种在应激反应中抗细胞凋亡的蛋白，在大鼠出生后的早期即广泛分布于中枢神经系统，其表达量在大脑中的分布不同并随个体年龄的变化而变化。Higd 1a 在海马、丘脑核、梨状内核和尾壳核高度表达，并随着出生后年龄的增长，其表达量也逐渐增加。在严重应激期间，即在缺血性心脏病、缺氧缺血性脑病和癌症的背景下，Higd 1a 从胞浆池移位到细胞核，且Higd 1a的核定位与应激的严重程度相关[30]。

综上所述，Higd 1a 对于HIBI 后的线粒体损伤程度起到了明确的缓冲作用，Higd 1a 沉默会影响细胞融合。这些证据都提示了Higd 1a 的表达在HIBI中的研究价值，然而目前国内外尚没有关于Higd 1a靶向治疗HIBI 的报道，外源性Higd 1a 靶向治疗HIBI 的疗效值得进一步探究。