MicroRNA-181b对2型糖尿病胰岛素分泌调节的作用及其机制研究*

曾维新，云川，李晓燕，李大伟

（海南医学院第一附属医院 内分泌科，海南 海口 570102）

糖尿病是一种常见的内分泌疾病，包括1 型和2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM），其中T2DM 可发生于任何年龄，是最主要的糖尿病类型。随着我国人民生活水平的提高和饮食方式的改变，T2DM 发病率逐年升高。目前约11.6%成年人患T2DM，预计到本世纪40 年代，国内糖尿病患者将会超过6亿[1]。胰岛β 细胞功能缺陷导致的胰岛素缺乏和胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）是T2DM 患者发病的最主要原因[2]。MicroRNA（miRNA）是一种具有保守序列的微小RNA，可以通过抑制或促进RNA降解来调节后续基因的表达。有研究发现，肥胖与瘦人群的miRNA 表达有显著差异[3]，而肥胖引起的脂质超载与T2DM 发病关系密切。DEHGHANI等[4]发现，T2DM 患者血清miR-181b 水平异常。NDRG2是NDRG 家族成员，与miRNA 类似，具有高度保守性。近年来研究发现，NDRG2 在糖尿病小鼠的胰腺中异常表达，可能参与胰岛素分泌[5]；同时肿瘤相关研究发现，NDRG2 可能是miR-181b 的下游靶基因[6]。基于此，本研究观察miR-181b 能否通过靶向调控下游基因NDRG2参与IR，探究其在T2DM 发病中的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂及仪器

细胞株选用小鼠胰岛β 细胞（美国ATCC）。荧光素酶检测试剂盒（美国Biovision 公司），miR-181b模拟物、miR181b inhibitor、阴性对照（上海吉满生物科技有限公司），转染试剂盒（赛默飞世尔科技中国有限公司），NDRG2 单克隆抗体、二抗（英国Abcam公司），辣根过氧化物酶（北京中杉金桥生物技术公司）。二氧化碳培养箱（常州恒隆仪器有限公司），酶标仪（赛默飞世尔科技中国有限公司），二级生物安全柜（BSC-1100IIA2-X，济南欧莱博科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养采用含10 μL/L β-巯基乙醇和10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液培养小鼠胰岛β细胞，培养条件为：37℃、5%二氧化碳培养箱恒温培养，当细胞生长至融合度＞80%开始进行细胞传代。

1.2.2 转染首先使用预测软件Targetsca（http://www.targetscan.org）和miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）进行靶基因预测，利用Primer 5.0软件进行引物设计，构建NDRG2 野生型（NDRG2WT-1uc）与突变型（NDRG2MUT-1uc）荧光素酶报告基因质粒。

1.2.3 荧光素酶报告基因实验检测相对荧光强度将培养后的小鼠胰岛β 细胞接种于24 孔板，继续培养过夜，待完全贴壁后采用脂质体转染法转染，分为Control 组（阴性对照）、NDRG2-WT 组（转染NDRG2WT-luc）、NDRG2-MUT组（转染NDRG2MUT-luc）、miR-181b mimics+NDRG2-WT 组（转染miR-181b 模拟物和NDRG2WT-luc）、miR-181b mimics+NDRG2-MUT 组（转染miR-181b 模拟物和NDRG2MUT-luc）、miR-181b inhibitor+NDRG2-WT 组（转 染miR-181b inhibitor 和 NDRG2WT-luc）、miR-181 binhibitor+NDRG2-MUT 组（转 染 miR-181b inhibitor 和NDRG2MUT-luc）。转染48 h 的细胞将用于后续实验。转染结束后检测海肾和萤火虫荧光素酶的荧光强度，以两者的比值来衡量相对活性，反映miR-181b与NDRG2 结合情况。

1.2.4 过表达和抑制 NDRG2根据LipofectamineTM2000 试剂盒说明书进行操作，所有质粒购自美国Addgene 公司。将pLenti6-NDRG2（过表达组）、pLenti6-Cherry（过表达对照组）、pLKONDRG2 shRNA（敲低组）、pLKO-Scramble（敲低对照组）分别与psPAX2 质粒、pMD2.G 质粒共同转染至小鼠胰岛β 细胞，转染后48 h 取上清液，采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测NDRG2 mRNA 的表达（按2-ΔΔCt法计算相对表达量）；Western blotting 检测NDRG2 蛋白的表达；葡萄糖刺激的胰岛素释放试验检测低浓度（5 mmol/L）和高浓度（20 mmol/L）葡萄糖条件下的胰岛素分泌量。

1.2.5 qRT-PCR检测 miR-181b 和 NDRG2 mRNA未转染的小鼠胰岛β 细胞培养48 h后，予以低浓度（5 mmol/L）和高浓度（20 mmol/L）葡萄糖刺激，收集上清液，以未加入葡萄糖为对照组，采用qRT-PCR 检测5 mmol/L 葡萄糖组、20 mmol/L 葡萄糖组及对照组小鼠胰岛β 细胞内源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 表达。

1.2.6 葡萄糖刺激的胰岛素释放试验检测胰岛素分泌量在低浓度（5 mmol/L）和高浓度（20 mmol/L）葡萄糖条件下，将miR-181b 模拟物（miR-181b mimics组）、miR-181b 抑制剂（miR-181b inhibitor 组）、阴性对照（Control 组）转染至小鼠胰岛β 细胞中，转染48 h 后采用葡萄糖刺激的胰岛素释放试验检测胰岛素分泌量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，多组比较用方差分析，进一步两两比较用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组相对荧光强度比较

Control 组相对荧光强度为（100.00±1.01）%、NDRG2-WT 组为（104.20±3.04）%、NDRG2-MUT 组为（98.00±2.12）%、miR-181b mimics+NDRG2-WT 组为（63.27±5.16）%、miR-181b mimics+NDRG2-MUT组 为（96.67±2.23）%、miR-181b inhibitor+NDRG2-WT组为（133.59±4.48）%、miR-181 binhibitor+NDRG2-MUT 组为（97.13±1.0）%。各组相对荧光强度比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=46.325，P=0.000）。见图1。

图1 miR-181b与NDRG2靶基因结合位点示意图

荧光素酶报告基因实验检测发现，miR-181b模拟物可以明显抑制NDRG2WT-luc 的3'-端非翻译区的表达，但对NDRG2-MUT 组和Control 组无明显影响；miR-181b inhibitor 可以加强NDRG2WT-luc 的3'-端非翻译区的表达，但对NDRG2-MUT 组和Control 组无明显影响。说明miR-181b 可以通过与NDRG2 的3'-端非翻译区结合来调控NDRG2 的表达。

2.2 NDRG2对胰岛素分泌的影响

过表达组与过表达对照组NDRG2 mRNA 和蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），过表达组均高于过表达对照组。在5 mmol/L 葡萄糖条件下，过表达组与过表达对照组胰岛素分泌量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖条件下，过表达组与过表达对照组胰岛素分泌量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），过表达对照组高于过表达组。见表1 和图2。

表1 过表达组与过表达对照组NDRG2 mRNA和蛋白相对表达量、胰岛素分泌量比较（）

表1 过表达组与过表达对照组NDRG2 mRNA和蛋白相对表达量、胰岛素分泌量比较（）

敲低组与敲低对照组NDRG2 mRNA 和蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），敲低组均低于敲低对照组。在5 mmol/L 葡萄糖条件下，敲低组与敲低对照组胰岛素分泌量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖条件下，敲低组与敲低对照组胰岛素分泌量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），敲低组高于敲低对照组。见表2 和图2。

表2 敲低组与敲低对照组NDRG2 mRNA和蛋白相对表达量、胰岛素分泌量比较（）

表2 敲低组与敲低对照组NDRG2 mRNA和蛋白相对表达量、胰岛素分泌量比较（）

图2 NDRG2蛋白的表达

2.3 高糖刺激对小鼠胰岛β细胞内源性miR-181b和NDRG2 mRNA表达的影响

5 mmol/L 葡萄糖组、20 mmol/L 葡萄糖组及对照组小鼠胰岛β 细胞内源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：5 mmol/L葡萄糖组与对照组的miR-181b 和NDRG2 mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；20 mmol/L 葡萄糖组miR-181b 相对表达量高于对照组和5 mmol/L 葡萄糖组（P＜0.05），NDRG2 mRNA 相对表达量低于对照组和5 mmol/L 葡萄糖组（P＜0.05）。见表3。

表3 3组小鼠胰岛β细胞内源性miR-181b和NDRG2 mRNA相对表达量比较（）

表3 3组小鼠胰岛β细胞内源性miR-181b和NDRG2 mRNA相对表达量比较（）

注：†与5 mmol/L葡萄糖组和对照组比较，P ＜0.05。

2.4 miR-181b对胰岛素分泌的影响

5 mmol/L葡萄糖条件下，Control 组、miR-181b mimics 组、miR-181b inhibitor 组胰岛素分泌量比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖条件下，3 组胰岛素分泌量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：miR-181b mimics 组高于Control 组（P＜0.05），miR-1b1 inhibitor 组低于Control组和miR-181b mimics 组（P＜0.05）。见表4。

表4 不同浓度葡萄糖条件下各组胰岛素分泌量比较（IU，）

表4 不同浓度葡萄糖条件下各组胰岛素分泌量比较（IU，）

注：①与Control 组比较，P ＜0.05；②与miR-181b mimics 组比较，P ＜0.05。

3 讨论

T2DM 占总的糖尿病人群的90%以上，是主要的糖尿病类型，也是仅次于心血管疾病和恶性肿瘤的严重危害人类健康的慢性疾病，该病由基因和环境等多种因素导致，主要特征是胰岛素相对或绝对不足导致高血糖状态，胰岛β 细胞分泌胰岛素功能障碍导致骨骼肌、肝脏、脂肪等组织发生胰岛素抵抗是T2DM 发病的主要原因。胰岛素是由胰岛β 细胞分泌的特异性激素，可以通过与肌肉、肝脏和脂肪等组织上的特异性受体结合，来调节葡萄糖代谢，维持血液葡萄糖稳定状态。胰岛素的分泌不仅受胰岛素基因的调控，而且受外源性营养物质和内源性因子的影响。随着分子生物学的飞跃发展，近年来研究发现糖尿病患者miRNA 谱表达异常[7]，miRNA 异常表达可能与胰岛β 细胞功能障碍、T2DM病情进展关系密切。

miRNA 是一类短链的非编码RNA，可以通过与其他靶基因的3'-非编码区结合，来调控其他RNA的转录和翻译。有研究表明，miR-181b 在肥胖小鼠中低表达，外源性注射miR-181b 后其胰岛素敏感性提高[8]。COPIER等[9]报道外周循环miR-181b 是糖尿病心肌病的生物标志物，可能是研究T2DM 的新靶点。本研究前期预实验发现NDRG2 上可能存在miR-181b 的靶向结合位点，且两者都与胰岛素抵抗关系密切，故本研究以小鼠胰岛β 细胞株为研究对象，观察miR-181b 是否能够通过靶向调控NDRG2参与T2DM 的发生、发展。荧光素酶报告基因实验检测结果发现，miR-181b mimics 和inhibitor 可以显著影响野生型NDRG2WT-luc 的3'-端非翻译区表达，但对突变型NDRG2MUT-1uc 和阴性对照无明显影响，提示miR-181b 可以通过与NDRG2 的3'-端非翻译区结合来调控NDRG2 的表达。高楠等[10]在胃癌细胞的培养过程中同样发现miR-181b 能与NDRG2 的3'-UTR 结合，提示miR-181b 可以与NDRG2 的3'-UTR结合。

小鼠胰岛β 细胞的胰岛素分泌功能与人体胰腺有高度相似性，是研究胰岛素分泌和糖尿病的理想细胞株之一。LI等[11]在肾癌细胞中发现，提高miR-181b 表达能抑制包括NDRG2 在内的多种基因表达。高楠等[10]在胃癌细胞中通过荧光素酶报告基因分析发现NDRG2 为miR-181b 的下游靶基因，提出通过抑制miR-181b 的表达来抑制NDRG2，进一步干扰细胞侵袭作用。NDRG2 属于NDRG 家族一员，位于染色体14q11.1，其在进化上非常保守，提示该基因在人类生命过程中具有重要作用。NDRG2 高表达于人体骨骼肌中，不仅参与肿瘤、氧化应激、细胞分化、增殖、凋亡等众多生理活动[12]，而且可能通过蛋白激酶Akt 磷酸化调节胰岛素分泌[12]。有学者通过Western blotting 检测糖尿病小鼠胰岛和骨骼肌NDRG2，发现胰腺NDRG2 表达增强[14]。本研究通过过表达和敲低NDRG2基因来验证NDRG2 是否能直接影响胰岛素分泌，结果发现在20 mmol/L 高糖刺激下，过表达组胰岛素分泌量显著降低，而敲低组则显著升高，提示NDRG2 对胰岛素分泌具有抑制作用。为了进一步探讨miR-181b 对NDRG2 的靶向调控是否会影响小鼠胰岛β 细胞分泌胰岛素，本研究进一步检测了胰岛素分泌量，结果发现在20 mmol/L 葡萄糖刺激下，小鼠胰岛β 细胞内源性miR-181b 相对表达量显著升高，NDRG2 mRNA 相对表达量显著降低，但是在5 mmol/L 葡萄糖刺激下无显著变化，说明高糖刺激会影响小鼠胰岛β 细胞内源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 表达变化，这2 个基因可能直接参与胰岛素分泌的调控。进一步添加miR-181b mimics 和 miR-181b inhinitor 并给予20 mmol/L 葡萄糖刺激后发现，miR-181b mimics 能显著提高NDGR2 表达，同时胰岛素分泌量显著升高，而miR-181b inhibitor 能显著下调NDGR2 表达，且胰岛素分泌量随之下降。这为miR-181b 能通过靶向调控NDRG2 介导胰岛素分泌，并参与T2DM 的发病过程提供了直接证据。

综上所述，miR-181b 不影响小鼠胰岛β 细胞增殖，但可以通过靶向抑制NDRG2 的表达来提高胰岛素分泌，可以为T2DM 的发病机制研究和治疗提供新思路。