达格列净对糖尿病大鼠血管内皮功能及PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响*

史丽，胡婷婷，李红，张三明，刘智慧，左惠玲，胡利梅，任卫东

（1.河北北方学院附属第一医院 内分泌科，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院 国际医疗部，河北 张家口 075000；3.张家口市卫生健康项目管理中心，河北张家口 075000；4.河北北方学院附属第一医院 核医学科，河北 张家口 075000）

糖尿病是一种常见的代谢紊乱性疾病，发病率呈逐年上升趋势，糖尿病大血管病变是其常见的严重并发症之一，也是患者死亡的主要原因，目前尚无有效措施预防及控制糖尿病大血管病变[1]。有研究显示，微血管病变导致血管内皮功能障碍是糖尿病大血管病变发生、发展的病理基础[2]。因此探寻有效防治糖尿病血管内皮损伤的药物对于防治糖尿病大血管病变有重要临床意义。达格列净是一种新型降糖药物，属于钠-葡萄糖协同转运蛋白2 抑制剂，能够降低血糖、血脂，延缓糖尿病进展[3]。陈姣等[4]研究显示，达格列净能够改善糖尿病合并心力衰竭患者的心功能和血管内皮功能，从而降低再入院率。武卫党等[5]研究显示，达格列净能够改善糖尿病心肌缺血大鼠心肌及血管功能。然而达格列净对糖尿病患者血管内皮功能的作用机制尚未明确。既往研究显示，上调人张力蛋白同源物基因（phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN）表达，可抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信号通路活化，减轻2 型糖尿病大鼠血管病变，抑制主动脉血管内皮损伤[6]。目前有关达格列净对糖尿病血管内皮功能的影响是否与调控PTEN/PI3K/Akt 信号通路有关，少见报道。因此，本研究探究达格列净对糖尿病大鼠血管内皮功能的影响，并分析其可能机制，以期为有效防治糖尿病大血管病变提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30 只SPF 级SD 雄性大鼠，6 周龄，体重180～210 g，平均（195±15）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2021-0029。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂达格列净片（国药准字J20170040，瑞典Astra Zeneca AB 公司），蛋白提取试剂盒、链脲佐菌霉素（Streptozotocin,STZ）（上海吉至生化科技有限公司），高脂饲料（江苏省协同医药生物工程有限公司），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司），内皮素1（Endothelin-1,ET-1）、缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（江西艾博因生物科技有限公司），兔抗鼠人张力蛋白同源物基因（phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin 抗体、山羊抗兔HRP 二抗（上海经科化学科技有限公司）。

1.2.2 主要仪器Optima™XPN 超速离心机（美国贝克曼库尔特生物科技有限公司），BD-SW50 光学显微镜（深圳市博视达光学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的复制及分组30 只大鼠随机分为对照组、模型组、达格列净组，各10 只。模型组、达格列净组给予高脂高糖饲料喂养，对照组给予普通饲料喂养。12 周后大鼠禁食不禁水12 h，模型组和达格列净组一次性尾静脉注射30 mg/kg STZ溶液（以pH 4.5 的0.1 mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液现用现配）；对照组一次性尾静脉注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。72 h 后经尾静脉测大鼠空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L 为2 型糖尿病模型复制成功[7]。

1.3.2 给药方式达格列净组大鼠模型复制成功后予以1 mg/（kg·d）[8]达格列净灌胃，连续4 周。模型组、对照组大鼠分别于同时间灌胃等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。

1.3.3 标本采集3 组大鼠均在末次给药结束后，用4%多聚甲醛麻醉。于腹主动脉取血2 mL，3 000 r/min 离心10 min，离心半径8 cm，取上清液置入-80℃冰箱冷冻保存备用。

取血结束后立即处死大鼠，打开胸腔剥离胸主动脉及腹主动脉血管，取血管外膜组织，分为两部分。一部分乙醇脱水、透明、石蜡包埋过夜，连续切片（6 μm 厚），用于HE 染色；另一部分保存于液氮中，用于Western blotting 检测。

1.3.4 ELISA 检测血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平

取各组大鼠腹主动脉取血的血清，严格按照试剂盒说明书进行操作，采用ELISA 检测血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平[9]。

1.3.5 HE 染色观察大鼠主动脉血管组织病理变化取各组大鼠主动脉血管组织切片，脱蜡，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，按照HE 染色试剂盒说明书进行染色，中性树胶封片。采用光学显微镜观察并采集图片，使用Image-Pro Plus 6.0 软件观察主动脉血管组织病理变化。

1.3.6 Western blotting 检测大鼠血管内皮组织PTEN/PI3K/Akt 信号通路蛋白的表达分别取3 组剩余主动脉血管组织标本制备组织匀浆，提取总蛋白并检测浓度及纯度，电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗（PTEN、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt）及内参β-actin，按1∶500 稀释，次日加入HRP 标记山羊抗兔二抗（1∶1 000），室温孵育2 h，显色、显影定影，以各蛋白条带灰度值的比值计算蛋白相对表达量[10]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

对照组小鼠每日饮水，尿量均正常，皮毛光滑、柔顺有光泽，精神状态良好，活动量大，反应敏捷；模型组小鼠精神萎靡，皮毛暗黄无光泽，活动量减少，出现典型的多饮、多食、多尿及体形消瘦现象；与模型组比较，达格列净组大鼠上述一般情况有所改善。

2.2 各组大鼠主动脉血管组织病理变化

对照组大鼠血管内皮完整，中层可见梭形平滑肌细胞，弹力纤维清晰、完整，呈环形排列；模型组大鼠主动脉内膜增厚，血管内皮中层平滑肌细胞增生，弹力纤维排列紊乱；与模型组比较，达格列净组大鼠主动脉上述病理变化有所改善。见图1。

图1 各组大鼠主动脉血管组织病理学变化（HE×200）

2.3 各组大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比较

3组大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，模型组、达格列净组大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平升高（P＜0.05），但达格列净组大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF水平低于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比较（n=10，）

表1 各组大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比较（n=10，）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

2.4 各组大鼠血管内皮组织PTEN/PI3K/Akt 信号通路蛋白相对表达量比较

3 组大鼠血管内皮组织PTEN、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，模型组、达格列净组大鼠血管内皮组织PTEN 蛋白相对表达量降低（P＜0.05），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；但达格列净组较模型组大鼠血管内皮组织PTEN蛋白相对表达量升高（P＜0.05），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠PTEN/PI3K/Akt信号通路蛋白相对表达量比较（n=10，）

表2 各组大鼠PTEN/PI3K/Akt信号通路蛋白相对表达量比较（n=10，）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

图2 各组大鼠血管内皮组织PTEN/PI3K/Akt信号通路蛋白的表达

3 讨论

糖尿病大血管病变是糖尿病长期慢性并发症，已成为糖尿病患者死亡的主要原因之一，严重影响患者生活质量及生命健康，目前仍缺乏理想的防治手段。糖尿病大血管病变发病机制复杂，研究证实，血管内皮功能损伤是其主要病理基础之一[11]。达格列净是新型口服降糖药，广泛应用于2 型糖尿病的治疗，对糖尿病血管病变有一定治疗作用。孙娟等[12]研究显示，达格列净能够改善胰岛功能并缓解糖尿病患者血管病变。史晓荻等[13]研究显示，达格列净对糖尿病患者血管内皮功能有一定改善作用，对防止并发症有积极作用。

ET-1、HIF-1α、VEGF 是由血管内皮细胞分泌的活性物质。有研究显示，在持续高血糖状态下，微血管内皮细胞受损，发生血管内皮功能障碍，促使ET-1、HIF-1α、VEGF 分泌增加，3 者可一定程度反映血管内皮功能损伤程度[14]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠主动脉内膜增厚，血管内皮中层平滑肌细胞增生，弹力纤维排列紊乱，而经达格列净处理后，大鼠主动脉上述病理变化有所改善；且与对照组比较，模型组、达格列净组大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平升高，但经达格列净药物处理后，大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平降低，说明达格列净可对糖尿病大鼠血管内皮功能发挥保护作用。

PI3K/Akt 信号通路是调节细胞生长、代谢的重要信号通路。有研究显示，持续高血糖能够刺激PI3K/Akt 信号通路活化，使PIP2 转化为第二信使PIP3，从而促进Akt 磷酸化和下游效应基因HIF-1α表达，引起VEGF 的表达，而血管内皮细胞异常增殖、迁移，促进糖尿病血管病变的发生[15]。PTEN是一种具有双重脂质磷酸酶活性的抑癌基因，有研究显示其能负向调控PI3K/Akt 信号通路[16]。韩利平等[17]研究显示，上调PTEN 表达可抑制PI3K/Akt信号通路活化，改善糖尿病大鼠血管病变损伤程度。本研究结果显示，与对照组比较，模型组、达格列净组大鼠血管内皮组织PTEN 蛋白相对表达量降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相对表达量升高；但达格列净组大鼠血管内皮组织PTEN 蛋白相对表达量升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相对表达量降低，与既往研究结果相似，说明达格列净可能通过上调PTEN 表达，抑制PI3K/Akt 信号通路活化，从而改善糖尿病大鼠血管内皮功能损伤，为防治糖尿病大血管病变提供一定理论依据。

综上所述，达格列净对糖尿病大鼠血管内皮功能损伤发挥保护作用，可能是通过促进PTEN/PI3K/Akt 信号通路活化来实现的。然而本研究并未能明确达格列净对PTEN/PI3K/Akt 信号通路的具体调控作用，后期将进行深入阐述。