牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的研究进展

2022-12-17姜海宇薛华平李家奎

养殖与饲料 2022年9期

姜海宇，薛华平，李家奎*

1.西藏农牧学院，西藏林芝 860000；2.深圳市绿诗源生物技术有限公司，广东深圳 518120

BVDV 属于黄病毒科瘟病毒属，与猪瘟病毒和羊边界病毒同属。BVDV 是主要感染牛的病原体，也可感染大多数反刍动物，1946 年，Olafson 等[1]在美国纽约州首次发现，后在全球陆续被报道。1980 年，李佑民等[2]在吉林分离出1 株与国外报道相同的BVDV，这是我国首次报道该病毒，并命名为184V株。经此，此病毒正式传入我国，在我国牛群中广泛流传。1990 年，洛桑列措等[3]报道在西藏牦牛体内又一次被分离。该病毒感染牛群后，以免疫抑制效应、呼吸道疾病（呼吸系统疾病）、胃肠道和繁殖障碍等为主要临床症状，病毒主要通过口鼻传播，上皮细胞和免疫细胞可帮助该病毒扩散至全身，目前，尚不清楚BVDV 是如何穿过气道中上皮细胞的屏障[4]。被BVDV 感染的牛可分为感染和持续感染（PI），持续感染的牛是轻度并且无症状的，进行血清学检测结果为抗体阴性，但其体内仍然带毒，与健康牛群接触时仍可将其传染给健康牛群，导致无法净化该病毒。世界卫生组织（OIE）与我国均将其归为法定报告的三类疫病。自1946 年在美国首次报道牛病毒性腹泻病毒后，其在全球范围内蔓延，尤其在澳大利亚、阿根延以及非洲和欧洲等养牛发达的地区。目前，我国养牛业迅速发展，自20 世纪90 年代在吉林首次发现后，至2005 年就已传播至少22 个省，至今已是遍布全国[5]。2021 年，杞艳萍[6]对陕西、宁夏、新疆、西藏4 省，共计17 个牛场，采集1 234份血清样本，利用RT- PCR 进行检测。1 234 份样本中，阳性89 份，14 个牛场存在BVDV。以上数据说明BVDV 在我国已经广泛流行，但我国养牛业相关人员对该病的理论知识尚有不足，本文查阅国内外相关资料并进行阐述总结，以期为基层工作者和生物研发人员防治此病提供参考。

1 BVDV 的生物学特性

BVDV 是球状的单股正链RNA 病毒，属瘟病毒属，与同属病毒具有血清学交叉反应[7]。BVDV 只有1 个血清型，但根据基因组5'UTR 和非结构蛋白Npro 的不同可以分为2 个基因型，BVDV Ⅰ型和BVDV Ⅱ型，BVDV Ⅰ型和BVDV Ⅱ型的基因组较为相似，不易辨别，但在某些基因区域可以进行基因比较，也有较大的生物学意义。目前，国内外对疫苗、体外诊断等的研发都广泛应用BVDV Ⅰ型。此外，在巴西、东南亚等地分离出了1 种新的瘟病毒，目前称为HoBi 样（BVDV Ⅲ型），其在基因与抗原性上与上述2 种基因型相关，也可引起与BVD相似的临床症状，但可能无法用传统方法检出。且瘟病毒抗原性和遗传性都存在高度多边性，目前已经发现BVDV Ⅰ型至少有22 个亚型，BVDV Ⅱ型也有4 个亚型。目前，我国流行的主要为BVDV Ⅰ型的Im、Ib 2 个亚型。

BVDV 可分为2 种生物型：致细胞病变型（CP），如singer 毒株；非致细胞病变型（NCP），如NY-1 毒株。NCP 型较为常见，虽然其不能使细胞发生病变，但仍然可以引起亚临床感染，使感染牛表现临床症状，并且与CP 型相比更容易引起牛流产。

2 BVDV 基因结构及特征

BVDV 全长约12.5 kb，1 个开放阅读框，12 个编码蛋白，从5'UTR 段开始，经过开放阅读框，到3'-UTR 结束，顺序为：Npro-Core-Erns-E1-E2-P7-NS2-3-NS4A-NS4B-NS5A-NSAB。两端甲基化修饰，其中Core、Erns、E1、E2 为结构蛋白，其余均为非结构蛋白。其病毒粒子为球形的二十面体，直径20～60 nm，病毒粒子从外到内依次为囊膜、衣壳、基因组RNA。Erns、E1、E2 组成囊膜蛋白，Core组成衣壳。病毒粒子对酸性环境较为敏感，不耐高温，56 ℃即可灭活。

3 BVDV 编码蛋白的主要功能

3.1 Npro 蛋白

Npro蛋白又称为P20 蛋白或前导蛋白酶，属于非结构蛋白，是BVDV 的第1 个蛋白，由164～168个氨基酸残基组成，分子质量20 ku[8]。Npro蛋白是高度保守的蛋白，目前BVDV 的种、型等的分类是根据Npro蛋白的差异进行区分[9]。2009 年，Henningson 等[10]采用对比试验将Npro蛋白保留和删除后感染犊牛，结果显示感染删除Npro的BVDV 的犊牛出现白细胞减少和淋巴细胞减少，而没有出现直肠温度升高或靶淋巴器官的淋巴细胞衰竭，淋巴组织中的抗原沉积极少；感染带有Npro的BVDV 的犊牛出现直肠温度升高、白细胞减少、淋巴细胞减少和淋巴组织中有明显的BVDV 抗原沉积的淋巴缺失。也表明了Npro蛋白与病毒毒力有关，缺失Npro蛋白的BVDV 突变体可能成为安全开发疫苗的候选。

3.2 Core 蛋白

Core蛋白又称p14 蛋白或C 蛋白，属非糖基化蛋白，与Erns、E1、E2 构成结构蛋白，由102 个氨基酸残基组成，与基因组RNA 构成病毒核心[11-12]，分子质量约14 ku，在许多不同的瘟病毒中高度保守。1999 年，Elahi 等[13]建立了一种新的重组腺病毒，它在四环素可调节启动子的控制下表达了BVDV 的核衣壳（C 蛋白或p14）。接种小鼠后，诱导小鼠产生了强烈的特异性免疫反应，证明c 蛋白（p14 蛋白）具有高免疫原性。Gong 等[14]研究表明，它与病毒的成熟和复制密切相关。

3.3 Erns 蛋白

Erns蛋白又称E0 蛋白或gp48 蛋白，由227 个氨基酸残基组成，为瘟病毒特有蛋白，Erns、E1、E2 三者均为包膜糖蛋白，展示在病毒颗粒的外部。E1 和E2 蛋白通过疏水氨基酸残基的延伸插入膜中。Erns在双链底物中充当“切口内切核糖核酸酶”降解ss－RNA。这有效防止了干扰素（IFN）的激活，并有助于在持续感染的动物中维持先天免疫耐受状态[15]。Erns蛋白具有高度保守区域，当BVDV 感染细胞后，Erns蛋白可被大量表达，这说明可以利用Erns蛋白开发疫苗或检测试剂盒、检测卡等，Erns蛋白也可调节细胞凋亡因子控制细胞凋亡[16-17]。

3.4 E1 蛋白

E1 蛋白又称gp25 蛋白，是囊膜蛋白，由195 个氨基酸残基组成，有3 个糖基化点位，分子质量约24 ku。目前，尚未在感染BVDV 的病牛血清中发现E1 蛋白抗体，据推测E1、E2 可能以二聚体形式出现[18]。

3.5 E2 蛋白

E2 蛋白又称gp53 蛋白，是囊膜蛋白，分子质量53 ku，是最主要的结构蛋白，E2 糖蛋白是与细胞表面受体结合所必需的，它还包含主要的抗原决定簇[19]。它是病毒诱导产生中和抗体的主要靶点，许多基于E2 的中和抗体可有效抑制病毒感染，但E2病毒保守性低，容易变异，正因如此也可将其作为基因型分类的依据，也是目前国内外学者的主要研究对象。吴桐忠等[20]建立E2 抗原蛋白的重组乳酸乳球菌，将其接种健康牛后，检测抗体水平。结果显示，可检测到特异性E2 抗体，具有良好的免疫原性并为开发疫苗奠定了基础。

3.6 P7 蛋白

P7 蛋白属于较小的非结构蛋白，分子质量为7 ku，位于结构蛋白与NS2 蛋白之间，大多数以二聚体（E2-P7）结构形式出现[21]。对RNA 的复制有着重要意义，是产生感染性病毒所必须的[18]。2014 年，Atoom 等[22]研究表明，P7 蛋白可以在脂质双分子膜上形成通道蛋白且具有离子通道活性。

3.7 NS2-3 蛋白

NS2-3 蛋白又称p125，是最大的非结构蛋白，分子质量约为125 ku，在瘟病毒属中属于高度保守的非结构蛋白，当其在非致细胞病变毒株中只以NS2-3（p125）蛋白一种形式存在。在致细胞病变型毒株中会发生突变，裂解为NS2（P45）和NS3（P80）蛋白。NS2 作为NS2-3 的一部分具有蛋白酶活性，可以促进NS2-3 蛋白裂解。其他NS2 蛋白的相关功能尚有待进一步研究。但NS3（P80）蛋白广泛受到国内外学者的关注，因其具有高度的免疫原性，疫苗毒感染主要针对NS3（P80）产生抗体，而自然感染的则针对结构蛋白产生抗体，因此可以根据NS3（P80）区分是疫苗毒还是野毒感染，对牛场牛病毒性腹泻的净化提供帮助[16]。可利用NS3（P80）蛋白作为包被抗原，建立ELISA 检测方法，用于流行病学检测，具有较高经济价值[23]。

3.8 NS4A、NS4B、NS5A、NSAB 蛋白

NS4A、NS4B、NS5A、NSAB 蛋白构成P175 蛋白，分别由64、347、496、718 个氨基酸残基组成。P175 蛋白是四者的前体，其占据整个多聚蛋白的1/3，其可以不断切割为成熟的NS4A（p10）蛋白、NS4B（p42）蛋白和p133 蛋白，p133 蛋白又不断加工为NS5A（p58）和NS5B（p75）蛋白。NS4A（p10）蛋白可参与非结构蛋白的裂解，可辅助NS3（P80）蛋白发挥蛋白酶活性。Suda 等[24]表明NS4B 可以诱导自噬体，在病毒复制过程中有重要作用。Bashir 等[25]研究表明，NS4B 具有一定免疫原性，并证实该蛋白具有诊断、疫苗接种和治疗等研究价值。NS5A（p58）蛋白具有亲水性，有RNA 聚合酶功能，参与病毒复制。NS5A 蛋白位于内质网，能和病毒IRES 元件结合，并且调控IRES 所介导的病毒基因翻译的整个过程[26]。NS5B（p75）在RNA 合成过程中发挥着重要作用。

4 诊断方法

4.1 血清学诊断

1）酶联免疫吸附试验（ELISA）。此方法是OIE推荐检测BVDV 的方法，可快速对大量样本进行检查。通过将已知的抗原抗体包被在聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合的原理进行检测，该方法既可定性又可定量，既可检测抗原也可检测抗体。操作简单，要求低，结果准确清晰，是临床上检测BVDV 的首选方法。与血清中和试验相比，符合率可达到95%以上[27]，可用于病毒的动态检测和群体检测，目前也是最常用的检测方法之一。韩美婧[28]建立了捕获ELISA 检测方法，结果表明特异性好、灵敏度高，稳定性强。2019 年，Tian 等[29]使用该方法对中国四川养殖场出现腹泻病例进行鉴定。

2）病毒中和试验（VNT）。该方法是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。童钦等[30]利用中和试验调查了内蒙古地区6 个奶牛场509 份血清样本，证明了内蒙古地区存在BVDV 的流行。但该方法易受其他因素影响，逐渐被ELISA 取代。

3）免疫荧光技术（IFA）。又称荧光抗体技术，利用抗原-抗体反应的原理进行组织或细胞内抗原物质的定位，该方法灵敏度高，检测速度快，特异性强，但对仪器要求较高，非特异性染色问题尚未完全解决，应用较少。

4）胶体金技术（GICT）。胶体金技术是利用抗原抗体特异性结合的原理进行体外诊断的一种检测方法，可根据不同需要制备不同的检测卡，此方法成本低、特异性好、便于操作、检测快速，但对于BVDV 抗原的检测卡尚不成熟，可作为未来兽医临床诊断的突破口。2019 年，梅力等[31]利用P80 抗原建立了一种检测BVDV 抗体的试纸条，并与国外ELISA 进行对比，阳性符合率达到86.7%，阴性符合率达到100%。

4.2 分子生物学检测

1）反转录-多聚链式反应（RT-PCR）。逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR），是如今动物疫病常用的检测方法之一，可用于BVDV 的鉴定与分型。该方法可以很好地区分细胞病变型和同属病毒，常用于部分地区流行病学调查[32-33]。

2）LAMP 检测方法。LAMP 是一种新型的核酸等温扩增技术，该方法通过对反应过程中所产生的焦磷酸镁白色沉淀的观察，实现对扩增反应全过程的监控，该方法检测结果直观，方法简便，反应快速、具有高灵敏度，特异性强，但对引物要求较高。张宇名等[34]建立了一步RT-LAMP 检测方法，并与商品化ELISA 试剂盒比较，共13 份样本，符合率达100%。

ELISA 与PCR 检测方法在世界各国应用广泛，比中和试验和免疫荧光技术灵敏性高，特异性好，但对仪器设备和操作人员要求较高，耗时时间长不宜推广，上述中胶体金检测卡的成本低、检测速度快，对操作人员无技术要求，可快速推广。Yao 等[35]建立了一种基于CRISPR-Cas13a 的NADL 菌株检测方法，虽然该方法在可视化和现场测试方面需要不断改进和加强，但它为快速、稳定和灵敏地检测BVDV 等RNA 病毒开辟了一种新的策略。

5 临床症状

BVDV 是一种易感动物高发并且死亡率高的一种综合征，可分为3 个类型，黏膜病（MD）、急性型、持续感染型（PI），大多数牛都会出现腹泻、发烧症状，体温超过40 ℃，伴随精神不振、厌食、呼吸系统疾病、消化系统疾病，严重者出现血便等，潜伏期一般5～7 d[36]。

持续感染型（PI）：持续感染型是牛场中最大的传染源，当妊娠初期的母牛感染BVDV 且产下犊牛时，犊牛由于免疫系统尚不发达，不能产生免疫应答，病毒就存在于动物体中产生PI 牛。当妊娠后期感染可导致流产、死胎等。PI 牛的分泌物包括唾液、粪便、鼻液等中都含有大量病毒，PI 牛大多数表面健康，但其终生带毒排毒，且在其体内检测不到抗体，是最容易被忽视的传染源，也是牛场净化BVDV 最大的阻碍。大多数PI 牛生长缓慢，免疫系统不完善，发育不良，会因二次感染而导致黏膜病而死亡[37]。

急性型：PI 牛虽然是BVDV 传播的病原之一，但感染后常见为急性型，急性病毒性腹泻的动物发病急，体温迅速升高，腹泻、流涎、流鼻涕等，病情严重者还会出现便血，最后脱水死亡[38]。相关报道显示，发病急的主要原因是机体为应对单核细胞吞噬，而不断产生炎症性细胞因子[39]。

黏膜病（MD）：黏膜病是牛感染BVDV 最为严重的类型，其虽不常见，但死亡率极高，几乎达到100%，黏膜病（MD）类型初期不表现临床症状，在表现临床症状后1 周左右死亡，可见动物重度腹泻、脱水、皮炎、蹄炎、淋巴组织坏死、体温升高。剖检可见动物胃肠道黏膜溃疡、糜烂。据报道，黏膜病产生的原因是当持续感染的动物二次感染相同或相似的CP 型，可引起NS3 蛋白重组，即可导致黏膜病。

6 流行情况

BVDV 可感染各品种牛、骆驼、猪等动物，8～24月龄最易感染，主要传染源为PI 牛和患病动物，可通过水平传播和接触传播感染，水平传播主要依靠畜禽间接触传播，如舔食带毒动物所分泌的液体；垂直传播主要依靠胎盘传播。该病全年可发病，冬、秋两季节居多。

自从1946 年该病毒在美国纽约州首次发现以来，BVDV 在全球范围内流传，尤其在一些发达国家。在哥伦比亚索塔基拉牛中BVDV 的血清阳性率达40%以上[40]。Demil 等[41]对埃塞俄比亚西北部贡德尔市奶牛进行流行病学调查发现，BVDV 抗体流行率为26.84%，畜群血清阳性率为68.3%。近年各国也都采取了净化BVDV 措施，取得了良好的效果，但根据流行病学调查发现，其在全球流行的形式依然严峻。Hou 等[42]对中国东部地区的36 群奶牛的牛奶进行了流行病学调查，结果表明，其中77.8%的样品中呈现BVDV 抗体阳性，进一步调查了2 个畜群的个体动物状况，阳性率分别为49.74%、24.64%，犊牛、小母牛和哺乳期奶牛的平均阳性率分别为15.94%、40.16%和41.7%。Ran 等[43]对中国多地进行流行病学调查，结果表明在奶牛群中最高BVDV 阳性率在中国的福建省达到90.0%，其次为陕西省（88.9%）和山东省（83.3%）。

常丽云等[44]采集了河北省唐山市38 个奶牛场共计788 份粪便样品，利用PCR 方法进行检测，结果显示BVDV 平均阳性率为29.82%，但滦南县阳性率高达45.38%。李天增等[45]利用血清中和试验对全国2 831 份血清进行检测，结果显示，阳性比例高达99.47%。罗润波等[46]对西藏、青海等4 省藏区牦牛共计897 份血清进行了流行病学调查，采用ELISA 方法检测，阳性样本179 份，阴性样本718份，其中，青海地区阳性率达30%，甘肃与四川阳性率分别为17.62%、10.13%，西藏阳性率最低为5.98%。以上数据均表明，牛病毒性腹泻病毒（BVDV）不仅在其他国家传播，在我国也已经广泛存在并且愈演愈烈，养牛行业基层工作者应予以重视，保护牛群健康，减少经济损失。

7 预防措施

7.1 检测

由于各场发病情况不同，建议群体检测BVDV抗体，了解场内感染情况，制定防控计划。检测BVDV 抗原，因PI 牛抗体检测阴性，抗原检测为阳性，排除PI 牛是场区净化BVDV 的关键。净化后制定合理检测计划，保持场区BVDV 检测阴性。

7.2 加强饲养管理、制定免疫计划

加强畜舍卫生工作，卫生与牛群的健康密切相关，可以减少病毒或细菌等微生物滋生，进而降低畜禽发病率。选取低毒广谱消毒药对畜禽生活区定期消毒，包括水槽、铁锹等日常生产用具，定期更换消毒药，避免产生耐药性，粪便尿液等进行无害化处理。为牛群提供优质饲料，提高免疫力，制定合理的免疫计划，选取正确疫苗，在幼年时期进行接种，提高免疫效果。群体免疫也不代表根除，因为BVDV毒株易变异，常导致胎牛不被保护，导致继续形成PI 牛，控制计划的重点在于降低疾病的流行率，而根除计划的重点是维持牛群检测为阴性。

7.3 加强人员管理、坚持自繁自养

严格遵守消杀制度，对于场外返回人员或车辆严格控制，不得随意进出。对场区员工进行专业培训，提高防范意识，避免疫情发生。建议自繁自养，尽量全进全出，减少交叉。但我国常引进新品种，应对精液等进行病原检测，对新引进品种一定要确保健康后才可混群饲养[47-49]。BVDV 是一种与养牛业高度相关的病原体。PI 型BVD 是轻度或无症状的，所以它们是健康牛感染BVDV 的主要来源。因此，从牛群中快速识别和清除PI 动物非常重要[50]。