补阳还五汤对脑缺血/再灌注损伤大鼠皮质区沉默信息调节因子1表达的影响

2022-12-16辛紫媛靳晓飞周晓红赵艳萌刘真一张彐宁高维娟

中国药理学通报 2022年12期

辛紫媛，靳晓飞，周晓红，赵艳萌，刘真一，张彐宁，高维娟，

(1. 承德医学院病理生理学教研室，河北承德 067000；2.河北中医学院河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北石家庄 050091)

补阳还五汤是治疗缺血性脑卒中气虚瘀证的代表方剂，最早记载于清朝王清任著《医林改错·下卷·瘫痿论》中，临床疗效确切，但其具体机制尚未明确[1]。脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)是缺血性脑卒中的重要病理过程，直接影响该病的预后和转归，其发生机制蕴含着缺血性脑卒中的潜在治疗靶点。沉默信息调节因子1(silent information regulation 1，SIRT1)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依赖性Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，通过去乙酰化组蛋白和一些非组蛋白底物参与基因调控[2]。SIRT1在神经退行性疾病和脑卒中等疾病中发挥着重要的调节作用[3]。本研究旨在探讨补阳还五汤对CIRI大鼠发挥保护作用时是否通过调节皮质区SIRT1蛋白，以期进一步挖掘补阳还五汤治疗CIRI的作用机制，为临床治疗缺血性脑卒中提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供的7～8周龄健康♂ SPF级SD大鼠，体质量(250～280) g，许可证号：SCXK(京)2016-0011，所有动物实验严格依据中国实验动物制度伦理审查委员会关于《实验动物管理条例》的指导方针，于河北中医学院动物中心适应性喂养1周后进行实验。

1.2 实验药物补阳还五汤购自北京同仁堂药店，其中包括黄芪120 g、当归6 g、赤芍5 g、红花3 g、地龙3 g、桃仁3 g、川芎3 g，水煎浓缩至100 mL，于4 ℃冰箱储存备用，每1 mL水煎液中含生药量约为1.43 g。阿托伐他汀购自美国辉瑞制药有限公司，国药准字H20051408。

1.3 主要试剂TTC 染液(G1017)、兔抗β-actin抗体(GB11001)、尼氏染液(G1036)均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；兔抗SIRT1抗体(#9475)购自Cell Signaling Technology公司；鼠抗SIRT1抗体(60303)购自Proteintech公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG (ZB-2301)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；蛋白酶抑制剂(P8340)购自Sigma公司；QuickBlockTM免疫染色封闭液(P0260)、含DAPI抗荧光淬灭封片液(P0131)购自碧云天生物；CY3-羊抗小鼠IgG抗体(BA1031)购自武汉博士德。

1.4 主要仪器MCAO 栓线(北京西浓科技有限公司)、脑切片模具(北京西浓科技有限公司)；组织包埋机(Leica)、轮转切片机(Leica)、冰冻切片机(Leica)、显微拍照系统(Leica)；蛋白质电泳及转膜仪(Bio-Rad)；Varioskan LUX 多功能酶标仪(Thermo)；FUSION FX5 Spectra多功能成像系统(Vilber)；PeriCam PSI激光散斑血流监测视频系统(Perimed)。

1.5 动物模型的建立与实验分组给药健康 SD ♂ 大鼠，参照文献[4]建立模型。模型组(MCAO/R)大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型缺血2 h后，再灌注72 h；补阳还五汤组(BYHWT)和阳性对照药阿托伐他汀组(Atorvastatin)于造模后，根据人鼠等效剂量换算给予大鼠剂量为补阳还五汤14.3 g·kg-1·d-1，阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1，术后等待大鼠完全清醒后立即灌胃给药，每24 h给药1次，共3次。

1.6 脑血流监测用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，剪开颅顶皮肤暴露前囟，均匀的将脑膜薄化，固定好探头，在该区域不时滴加生理盐水保持脑膜湿润。应用PeriCam PSI 激光散斑血流监测视频系统动态监测大鼠缺血前、缺血中、缺血/再灌注后局部脑血流量变化，选取感兴趣区域(region of interest，ROI)，以ROI值代表相应区域内微循环血流灌注量，计算缺血侧局部脑血流量占基线水平的百分比。

1.7 神经功能学评分缺血2 h/再灌注72 h后，根据 Zea Longa 5分制评分标准，采用盲法观察大鼠神经功能学评分并记录。评分标准为：0分，无神经功能缺损的症状；1分，提尾时不能伸展对侧前爪并内旋；2分，爬行时向对侧转圈；3分，爬行时向对侧倾倒；4分，不能行走或意识丧失。

1.8TTC染色测定脑梗死体积大鼠麻醉后迅速断头取出完整脑组织，-20 ℃冰箱中冷冻30 min，脑切片模具中制备2 mm的连续冠状脑片，在TTC溶液中37 ℃避光浸染30 min，染色完成后放入10%中性福尔马林固定液中固定24 h，脑组织连续冠状切片按自后向前的顺序摆放拍照，ImageJ软件测定脑片白色缺血梗死区体积和红色正常组织体积，计算梗死体积百分率。

1.9 尼氏染色观察皮质区神经细胞形态厚度5 μm石蜡切片脱蜡至水，经尼氏染液染色2～5 min流水水洗，0.1 %的冰醋酸分化，脱水透明，稍干燥中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，观察神经细胞形态，应用ImageJ软件计算神经细胞数量。

1.10 Western blot检测皮质区SIRT1蛋白表达约60 μg提取总蛋白，按1 ∶10加入组织裂解液低温匀浆，取上清液BCA法进行蛋白定量；按4 ∶1加入5×loading buffer后100 ℃金属浴10 min使蛋白变性；蛋白上样进行SDS-PAGE 凝胶电泳，并转移到PVDF膜上；室温下在5%脱脂奶粉中封闭2 h，TBST洗膜后；滴加一抗SIRT1抗体(1 ∶1 000)及内参抗β-actin(1 ∶2 000)抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后；加入二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜后；ECL液显色，使用VisionCapt软件获取图像并分析，以β-actin为内参照蛋白，通过分析目的蛋白与内参照蛋白的灰度比值，得出目的蛋白的相对表达水平。

1.11 免疫荧光染色检测皮质区SIRT1荧光表达厚度8 μm的冰冻切片用快速封闭液封闭15 min，滴加抗SIRT1抗体(1 ∶500) 4 ℃孵育过夜，TBST洗片；滴加CY3-羊抗小鼠IgG抗体(1 ∶100)，室温避光孵育1 h，TBST洗片；滴加含DAPI抗荧光淬灭剂封片后，避光保存并在荧光显微镜下观察拍照，观察SIRT1蛋白表达位置以及荧光表达强度。

2 结果

2.1 脑血流量评价模型建立成功大鼠缺血前脑血流ROI值为基线值，插入线栓阻塞后ROI值呈现明显的下降趋势且降幅达到基线65%以上，恢复血液再灌注后ROI值明显的上升趋势超过80%以上，证明造模成功(Fig 1)。

2.2 各组大鼠神经功能缺损的变化神经功能学评分显示，与Sham组相比，MCAO/R组大鼠神经功能缺损程度严重，神经功能评分明显升高(P<0.05)；与MCAO/R组相比，BYHWT组和Atorvastatin组大鼠神经功能缺损程度减轻，评分明显降低(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 1 Cerebral blood flow monitoring

Fig 2 Neurological deficit score of rats in each group n=9)

2.3 各组大鼠脑梗死体积变化TTC染色显示，与Sham组相比，MCAO/R组左侧大鼠脑组织出现明显白色梗死灶(P<0.05)；与MCAO/R组相比，BYHWT组和Atorvastatin组大鼠脑梗死体积明显减小(P<0.05)(Fig 3)。

2.4 各组大鼠皮质区神经细胞损伤的变化尼氏染色显示，Sham组大鼠神经细胞排列整齐、紧密，胞核清晰，尼氏体大、呈深蓝色，神经细胞数量丰富。与Sham组相比，MCAO/R组细胞损伤严重、排列不规整，细胞核碎裂、溶解呈空泡状，尼氏体颜色变浅、解体甚至消失，部分神经细胞丢失、数量明显减少(P<0.05)；与MCAO/R组相比，BYHWT组和Atorvastatin组细胞损伤均有所改善、形态较完整、排列较整齐，尼氏体又重新出现，完整神经细胞数量增多(P<0.05)(Fig 4)。

2.5 各组大鼠皮质区 SIRT1 蛋白表达的变化Western blot检测显示，与Sham组相比，MCAO/R组SIRT1蛋白表达下降(P<0.05)；与MCAO/R组相比，BYHWT组和Atorvastatin组可明显提升SIRT1蛋白表达强度(P<0.05)(Fig 5)。

2.6 各组大鼠皮质区 SIRT1 荧光表达的变化免疫荧光检测显示，细胞核为蓝色荧光标记，SIRT1为红色荧光标记，蓝色荧光与红色荧光部分重合，红色荧光也可在蓝色荧光周围显示，提示SIRT1在缺血侧脑组织细胞核和细胞质中均有表达。缺血2 h/再灌注72 h后，与Sham组相比，MCAO/R组红色荧光减少提示 SIRT1 表达下降，BYHWT和Atorvastatin组红色荧光增强，提示可提升SIRT1表达(Fig 6)。

Fig 3 Cerebral infarction volume of rats in each group n=3)

3 讨论

脑卒中是严重威胁人类生命健康的常见疾病之一，主要是由于高血压、吸烟、糖尿病、血脂异常、不良饮食、缺乏运动和肥胖等不良因素诱发，大约80%的脑卒中与缺血性脑卒中有关[5]。缺血性脑卒中可导致严重的脑功能障碍，具有较高的发病率、致残率、复发率和死亡率，严重影响患者的生活质量[6]。临床上主要通过溶栓和栓子切除术快速重建血液循环，成功地恢复血液灌注后进一步加重损伤，导致 CIRI[7]。 CIRI 涉及一系列复杂的病理生理过程，现代医学研究发现能量衰竭、兴奋性氨基酸毒性、神经炎症、神经细胞凋亡和氧化应激等多个环节参与该进程[8]。治疗急性缺血性脑卒中的关键是拯救围绕在缺血性核心梗死区周围的皮质缺血半暗带缺血脑组织，该区域没有遭受不可逆损伤且可以恢复[9]。探索CIRI的致病机理和作用靶点对脑卒中的发生、发展以及预后都发挥着重要的作用。

Fig 4 Morphological changes of cortical nerve cells in each group n=3)

Fig 5 SIRT1 protein expression in cortical area of rats in each group n=3)

翻译后修饰在基因表达调控中发挥重要作用，sirtuins是NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶，随着近年来对组蛋白基因修饰的深入研究，已经证明了组蛋白去乙酰化与神经系统疾病密切相关[10]。1999年SIRT1在人类中被首次发现，是sirtuins蛋白家族中第一个被发现的成员，位于染色体10 q，在人类细菌中高度保守[11]。可定位于细胞核和细胞质，在细胞质中它促进了细胞核与细胞质的穿梭，通过多种信号和生存途径参与机体调控[12]。脑组织缺血缺氧后，SIRT1作为能量调节的枢纽，利用辅酶NAD+去乙酰化靶蛋白，不仅在调节神经细胞能量代谢方面发挥重要作用，而且在抗氧化应激、减轻炎症、抗细胞凋亡等方面也发挥着减轻脑组织缺血后再灌注损伤的作用[13]。

脑卒中在中医被称之为中风，《内经》谓其“风性善行而数变”，以吐沫身直、口噤筋急、舌强而不能言、手足不遂为主要病证，起病之急、发展之迅速[14]。经典名方补阳还五汤主治证为气虚血滞，脉络瘀阻所致中风，7种单味药黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花和桃仁诸药合用，共奏补气活血通络之功效，全方具有气旺则血行，活血不伤正的配伍特点[15]。已有研究表明，通过建立脑微血管内皮细胞氧糖剥夺再灌注损伤模型，发现补阳还五汤含药血清对脑微血管内皮细胞氧糖剥夺再灌注诱导的氧化应激损伤的保护作用可能是通过调节SIRT1实现的[16]。补阳还五汤含药血清可上调SIRT1表达，下调基质金属蛋白酶2表达，进而防止人血管平滑肌细胞的年龄相关迁移和侵袭[17]。补阳还五汤可靶向调节海马区SIRT1 / VEGF通路促进CIRI后血管新生[18]。

本研究建立MCAO大鼠模型缺血2 h/再灌注72 h，我们观察到大鼠出现大面积脑梗死，伴随明显的皮质神经细胞损伤，经补阳还五汤治疗后组织损伤明显改善，观察到皮质SIRT1蛋白的表达明显升高，提示补阳还五汤可能通过激活皮质区SIRT1靶点进而发挥保护作用，其中补阳还五汤在CIRI中调节SIRT1的具体作用机制是我们课题组进一步探讨的方向。