基于TSPO的芍药内酯苷抗抑郁作用及机制初探

王玉露，贾 铷，陈 燕，张淑玲，周小如，王 涛

(1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2. 福建中医药大学附属康复医院药学部，福建 福州 350001)

情绪障碍是最普遍的精神疾病之一，本世纪人类已进入“精神病时代”，二十一世纪也被称为“抑郁症的世纪”。抑郁症是一种严重的情绪障碍，对全球健康造成重大负担。抑郁症具有高发病、高自杀、高复发、高致残的特点，而识别率、就诊率、治疗率却较低，它作为严重的公共卫生问题和突出社会问题已成为我国和国际社会的共识。目前临床应用的有效抗抑郁药物多数为化学制品，尽管可以改善抑郁症状，但由于药物的不良反应严重(例如自杀倾向，性功能障碍和睡眠障碍)，约30%的抑郁症患者对目前市面上的抗抑郁药不能耐受[1]，许多患者被迫停止治疗。因此，现急需研究出新靶点且毒副作用小的新型天然抗抑郁药。

抑郁症发病机制复杂，目前研究表明，抑郁症的发病可能与脑内单胺类神经功能失衡、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴过度活化、脑源性神经营养因子(BDNF)低下等因素有关，而HPA轴过度活化可导致脑内海马神经元坏死、减少。临床的抗抑郁药多数是通过调节脑内单胺类神经功能、抑制HPA轴并增加神经营养与可塑性等机制来发挥治疗抑郁症的作用。

TSPO(translocator protein 18 ku，TSPO)是由5个位于线粒体外膜的跨膜蛋白组成的，在大脑主要存在于神经胶质细胞，与配体结合后可促进胆固醇转运入线粒体膜内，从而促进脑内神经类固醇(neurosteroids，NSTs)合成。激活TSPO促进胆固醇从胞质转运进入线粒体是NSTs合成的限速步骤，在线粒体内，胆固醇被侧链清除细胞色素P450酶转化为孕烯醇酮，然后孕烯醇酮转移至胞质，在系列酶作用下合成其他NSTs。例如，在3β-羟基类固醇脱氢酶催化孕烯醇酮转变为孕酮，并进一步在5α-还原酶等作用下代谢为别孕烯醇酮等(即四氢孕酮)。NSTs在人类情绪和应激反应调节中发挥重要作用，在抑郁、焦虑等精神系统疾病的治疗中表现出潜在的应用价值。TSPO为基于胶质细胞的新生物标志物，是近年来发现的新抗抑郁作用靶点[2]。在一些新药研究中也发现TSPO与抑郁症有密切的相关性[3]。

目前，传统中药为抑郁症的治疗提供了一种潜在的选择。尉强[4]对大叶蒟进行修饰，得到的衍生物3-(3,4-甲基二氧基-5-三氟甲基苯基)-2-丙烯酸异丁基酰胺(G11-5)具有显著的抗抑郁活性且脂溶性高，在社会失败应激模型的抑郁症小鼠中发现G11-5能在一定程度地上调TSPO表达，表明G11-5可能介导线粒体自噬信号通路而实现抗抑郁作用。李冬梅[5]在探究乌灵菌粉抗抑郁作用的分子机制中，建立了习得性无助抑郁症动物模型，发现乌灵菌粉改变了与TSPO介导的线粒体自噬信号通路相关的多种蛋白质的表达水平，从而实现抗抑郁作用。以上研究都说明TSPO与抑郁症有一定的相关性，并且中药有通过TSPO介导其抗抑郁作用的潜能。

芍药内酯苷(albiflorin)，又名白芍苷，在芍药中的含量仅次于芍药苷，同为芍药中具有代表性的单萜类化合物。芍药又称为牡丹，白芍来源于毛茛科植物芍药的根，是一种可以治疗郁症的中草药，常用于中药方剂，包括四逆散和逍遥散。在这些成分中，单萜糖苷提取物如芍药苷和芍药内酯苷通常被描述为白芍最重要的活性成分[6]。据报道[7]，芍药苷在大鼠和小鼠体内具有抗抑郁作用。且何淑芬等[8]在芍药苷与脑胶质瘤细胞中TSPO亲合力的研究时，发现与阳性药TSPO特异性配体PK11195对比，无显著性差异，提示芍药苷与TSPO有高亲合力。然而，单萜糖苷提取物的另一重要组分芍药内酯苷的抗抑郁作用较少报道。本课题组前期研究发现，芍药内酯苷在小鼠绝望模型及大鼠慢性应激抑郁模型上有显著的抗抑郁作用，并能增加脑内单胺递质及BDNF的含量[9]。

在本课题中我们建立了小鼠慢性不可预知的应激模型，利用了TSPO拮抗剂PK11195，首先在动物实验中验证了芍药内酯苷抗抑郁作用与TSPO的关系，并通过分子生物学方法进一步验证了芍药内酯苷对TSPO及其下游NSTs的影响，探讨TSPO在芍药内酯苷防治抑郁症行为学效应及其作用机制中的重要作用，从而为之后更深一步的研究和临床应用提供理论支持。

1 材料与方法

清洁级ICR种小鼠80只，♂，体质量(18～22) g，购于吴氏动物实验公司[合格证号：SCXK(闽)201-0002]。动物分笼，在安静、避强光且通风的实验室内适应性饲养7 d，恒温(22±2)℃，自然昼夜，自由食水。

芍药内酯苷(上海源叶生物科技有限公司，B21149-100 mg)；盐酸氟西汀(上海源叶生物科技有限公司，S27345-5 g)；TSPO拮抗剂PK11195(上海源叶生物科技有限公司，B6401-10 mg)；蔗糖(上海源叶生物科技有限公司，S11055-100 g)；小鼠孕酮ELISA试剂盒(Enzo，美国，CATALOG NUMBER：ADI-900-011)；小鼠四氢孕酮ELISA试剂盒(ARBOR ASSAYS，美国，CATALOG NUMBER：K061-H1)；TSPO一抗(Abcam,美国，ab213654);二抗(Abcam,美国，ab205718)。

TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)：KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；EX224分析天平(奥豪斯仪器上海有限公司)；开场箱(50 cm×50 cm×30 cm，自制)；PM-200型高架十字迷宫装置(成都泰盟科技有限公司)。

1.1 药物的制备

1.1.1芍药内酯苷的制备[9]给药剂量依据前期实验结果配制如下：①低剂量组：0.875 mg药品溶于5 mL蒸馏水中(3.5 mg·kg-1)；②中剂量组：1.75 mg药品溶于5 mL蒸馏水中(7 mg·kg-1)；③高剂量组：3.5 mg药品溶于5 mL蒸馏水中(14 mg·kg-1)。按分组灌胃给药。

1.1.2盐酸氟西汀的制备 现用现配，以蒸馏水溶解，5 mg药品溶于10 mL蒸馏水中(10 mg·kg-1)，按分组灌胃给药。

1.1.3TSPO拮抗剂PK11195的制备[10]现用现配，0.75 mg的PK11195以含0.4%Tween 80的蒸馏水5 mL，37 ℃超声波水浴加热30 min，配制成均一混悬液(3 mg·kg-1)，腹腔注射。

1.1.4蔗糖溶液的制备 现用现配，10 g的蔗糖溶于1 000 mL蒸馏水中，配置成1%(W/V)的蔗糖溶液。

1.2 糖水偏好试验(sucrose preference test，SPT)将80只小鼠进行糖水偏好测试，实验流程如Fig 1所示。糖水偏好测试包括培训和测试两个过程。小鼠购入后适应性饲养7 d后，首先进行48 h蔗糖饮水训练，前24 h只给予1%蔗糖水，后24 h同时给予1%蔗糖水和饮用水进行训练，训练结束后断水断食24 h，然后进行糖水基线测试，用下式计算蔗糖偏好值(SP)：SP/%=蔗糖摄入量(g)/[蔗糖摄入量(g)+水摄入量(g)]×100%。

1.3 动物分组及给药

将80只♂ ICR小鼠按SP值均衡分组，每组10只，分为8组即空白组、模型组、氟西汀组、芍药内酯苷低、中、高剂量组、PK11195组和芍药内酯苷高剂量+PK11195组。其中，芍药内酯苷高剂量+PK11195组中的给药顺序为：芍药内酯苷高剂量灌胃30 min后腹腔注射PK11195。在建立CUS模型期间，每天1次以0.2 mL/10 g体质量进行给药，连续给药35 d。

Fig 1 Flow chart of experimental method

SPT：Sucrose Preference Test；OFT：Open Field Test；MBT：Marble Burying Test；EPMT：Elevated Plus Maze Test；NSFT：Novelty Suppressed Feeding Test

1.4 建立小鼠慢性不可预知应激模型(chronic unpredictable stress，CUS)小鼠经受5周的慢性不可预见的应激(CUS)。CUS方案[9,11]稍作修改，包括9种应激：(1)24 h禁食；(2)24 h禁水；(3)暴露于频闪和白噪声2 h；(4)笼子倾斜(45°)12 h；(5)通宵照明；(6)潮湿笼24 h；(7)强迫游泳4 ℃，3 min；(8)束缚2 h；(9)夹尾6 min。

应激在每天给药1 h后以半随机的方式施用，每天1次或2次。应激顺序每周改变，使应激程序不可预测。这些应激被随机安排在1周内，并在整个5周的实验中重复。对照动物被安置在一个单独的房间，并与受应激的动物没有接触。

1.5 行为学测试在进行35 d CUS的最后一天，再次进行糖水偏好测试以估计CUS模型和药物作用，确认是否建模成功，之后进行如下所述的行为学测试。

1.5.1糖水偏好测试 同1.2。

1.5.2开场试验(open field test，OFT) 根据文献稍作修改[9]。小鼠开场试验装置为长50 cm，宽50 cm，高30 cm的无盖正方形木箱，四周和底部均为灰黑色，用黑线将底面划分为25个面积相等的方格，逐只进行测试。对待测小鼠在陌生新环境的隔音房间内进行。实验开始时将小鼠置于装置中心方格内，用录像机记录小鼠6 min内的活动情况。记录指标包括：水平活动得分即小鼠穿越底面方格数(以小鼠四爪均进入方格记为1次)；垂直活动得分即小鼠直立的次数(以小鼠两前肢离地至再放下记为1次)。每只动物只被测定1次，且被测定后需将其排泄物处理干净，以保持装置清洁，无测试小鼠气味。

1.5.3新奇抑制摄食试验[9](novelty suppressed feeding test，NSFT) 小鼠禁食24 h后，依次从固定角落被放入一个新的空鼠笼内，中心放置已称重的粮食。放入后，检测小鼠首次进食的潜伏时间以及10 min消耗食物重量。小鼠进食标准为开始咀嚼食物，而不仅仅嗅食或摆弄食物。以吃食的潜伏期(s)为观测指标。

1.5.4高架十字迷宫试验[9](elevated plus maze test，EPMT) 将小鼠按头朝开臂的方向置于十字迷宫中央，高架的高度不超过30 cm，观察者与迷宫至少保持1 m的距离，摄像机记录5 min内小鼠在开臂和闭臂内的停留时间和进入次数。分别以小鼠在开臂的停留时间、进入开臂的次数除以开闭臂停留总时间、进入开闭臂总次数计算百分数。

1.5.5弹珠埋葬试验(marble burying test，MBT) 弹珠埋葬测试已被定性为测定小鼠焦虑症状的模型[12]。将小鼠单独放置在一个长30 cm，宽30 cm，高30 cm的鼠笼中，其中含有20个干净的玻璃球，均匀地放在直径5 cm圆形深坑的旁边。测试30 min，计数被埋藏的弹珠。

1.5.6取材 行为学测试后，小鼠被迅速断头处死，取双侧海马，迅速冷冻并在-80 ℃下储存待用。取3只用于Western blot法检测海马TSPO表达，4只用于小鼠海马孕酮(PROG)、四氢孕酮(ALLO)含量测定。

1.6 Western blot法检测海马TSPO表达分离小鼠双侧海马组织，使用RIPA裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度。加入上样缓冲液，变性后保存至-80 ℃冰箱备用。在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白(50 μg/泳道)，并转移到PVDF膜上。封闭1 h后，将膜与兔多克隆抗TSPO(1 ∶1 000)或抗β-actin(1 ∶1 000)抗体在带有Tween 20的Tris缓冲液中孵育4 ℃摇床过夜，在TBS-T中漂洗3×10 min后，加二抗孵育1 h，取出后漂洗，加入ECL化学发光底物，使用红外成像系统进行成像。采用目的基因与内参基因的吸光度比值表示相应蛋白的相对表达量。

1.7 小鼠海马孕酮(PROG)、四氢孕酮(ALLO)含量测定按照孕酮、四氢孕酮试剂盒说明书进行操作和计算。

2 结果

2.1 芍药内酯苷对慢性应激模型小鼠抑郁样行为的影响与正常组比较，CUS模型组的SP值、水平活动得分和垂直活动得分都明显降低(P<0.01；P<0.01；P<0.05)，摄食潜伏期明显延长(P<0.01)，说明慢性应激模型造模成功。与模型组相比，氟西汀组(P<0.01；P<0.01；P<0.01)、芍药内酯苷低、中、高剂量组(P<0.01，P<0.01；P<0.01，P<0.01，P<0.05；P<0.01，P<0.01，P<0.05)的SP值、水平活动得分和垂直活动得分均有明显的升高，摄食潜伏期(P<0.01)明显缩短，说明芍药内酯苷具有显著的抗抑郁作用，其作用与氟西汀相当；而PK11195组与模型组相比差异没有显著性，并且PK11195能逆转芍药内酯苷高剂量组的作用(P<0.05，P<0.05，P<0.05；P<0.01)。见Tab 1。

2.2 芍药内酯苷对慢性应激模型小鼠焦虑样行为的影响与正常组相比，CUS模型组小鼠开臂时间百分比(P<0.01)、开臂次数百分比(P<0.05)明显降低，弹珠埋葬数量明显增多(P<0.01)；与模型组相比，氟西汀组(P<0.01)、芍药内酯苷组(P<0.01；P<0.01，P<0.05；P<0.05，P<0.01)能够逆转这一降低的趋势，说明芍药内酯苷能改善CUS小鼠焦虑样行为，并且PK11195能逆转芍药内酯苷高剂量组的作用(P<0.05)。见Tab 2。

2.3 芍药内酯苷对慢性应激模型小鼠海马TSPO表达的影响与正常组相比，CUS模型组小鼠海马TSPO表达明显降低(P<0.05)；与模型组相比，氟西汀组、芍药内酯苷组能够逆转这一降低的趋势(P<0.01)，说明芍药内酯苷能改善CUS小鼠海马TSPO 减少的情况，并且PK11195能逆转芍药内酯苷高剂量组的作用(P<0.05)。

2.4 芍药内酯苷对慢性应激模型小鼠海马孕酮、四氢孕酮含量的影响与正常组相比，CUS模型组小鼠海马孕酮和四氢孕酮含量明显降低(P<0.01)；与模型组相比，氟西汀组(P<0.01)、芍药内酯苷低、中、高剂量组(P<0.05；P<0.01；P<0.01)能够逆转这一降低的趋势，说明芍药内酯苷能升高CUS小鼠海马孕酮和四氢孕酮含量，并且PK11195能逆转芍药内酯苷高剂量组的作用(P<0.01)。见Tab 3。

Tab 1 Effects of repeated administration of albiflorin on depressive-like behavior in CUS n=10)

Tab 2 Effects of administration of albiflorin on anxiety-like behavior in CUS mice n=10)

Fig 2 Effect of albiflorin on expression of TSPO in hippocampus of CUS mice n=3)

Tab 3 Effects of albiflorin on progesterone and tetrahydroprogesterone in hippocampus of CUS mice n=4)

3 讨论

虽然白芍在临床广泛用于治疗情绪失调类疾病，但研究其具体作用机制的药理报道还较为缺乏。本课题组在前期实验中发现，芍药内酯苷在大小鼠抑郁模型中具有显著抗抑郁作用[9]。为了进一步研究其抗抑郁机制，我们利用经典的小鼠慢性不可预知抑郁模型(CUS)，并在药物分组中增加了TSPO拮抗药PK11195组，以验证药物的抗抑郁作用与抗抑郁新靶点TSPO的关系。

行为学实验选取糖水偏好试验、开场试验和新奇抑制摄食试验来验证药物的抗抑郁药效。糖水偏嗜度实验是判断快感缺失的一种主要的行为学变化，而快感缺失是抑郁症的核心症状。这些症状表现为对奖赏的低应答反应，比如对糖水摄入的减少[13]，实验结果显示CUS小鼠的糖水偏嗜度显著降低，阳性药和芍药内酯苷不同剂量组可逆转此作用，说明药物对CUS具有改善抑郁症快感缺失的症状。为了进一步验证药物的抗抑郁药效，我们继续选取了开场试验和新奇抑制摄食试验来验证药效，其中，开场试验可以用来评价动物对一些急性刺激的反应，比如噪音等，在应激状态下动物的活动量会减少[14]；新奇抑制摄食本为焦虑模型，主要反映矛盾冲突状态，但也常用于评价抗抑郁药的慢性作用[15]。在开场试验中，药物能明显逆转CUS小鼠自发活动减少的症状；在新奇抑制摄食试验中，药物能逆转CUS小鼠摄食潜伏期延长的作用，说明芍药内酯苷能增强抑郁小鼠的摄食欲望。在这3个试验中，芍药内酯苷不同剂量组间无显著性差异，PK11195都可以逆转芍药内酯苷高剂量组的作用，而PK11195单用无作用，说明药物的抗抑郁作用可能与TSPO相关，并且3个剂量均有效。

因抑郁症常伴随焦虑症状，因此我们对慢性应激小鼠进行了高架十字迷宫和弹珠埋葬测试[12]，检测药物是否具有抗焦虑的作用。高架十字迷宫试验结果发现，CUS小鼠进入开臂的时间和次数百分比显著降低，说明抑郁小鼠伴有明显的焦虑症状，而芍药内酯苷可以逆转这一现象；在弹珠埋葬测试中，药物也能明显减少CUS小鼠埋藏大理石数量增多的现象，说明芍药内酯苷能缓解抑郁小鼠的焦虑样症状。同时 PK11195能够逆转高剂量芍药内酯苷的作用，说明其抗焦虑作用也与TSPO相关。

为了进一步验证其作用机制，我们进行了Western blot和ELISA测试，检测小鼠海马区TSPO及其下游NSTs孕酮和四氢孕酮含量。实验结果发现，芍药内酯苷能增加CUS小鼠海马区TSPO、孕酮和四氢孕酮含量。文献证明[16]，TSPO为基于胶质细胞的新生物标志物，是近年来发现的最新抗抑郁作用靶点，目前国外研究发现，TSPO主要存在于类固醇合成组织中，包括大脑，在脑内主要分布于神经胶质细胞的线粒体外膜上，可以把胆固醇从线粒体膜外转运到膜内，合成NSTs(如四氢孕酮、孕烯醇酮等)，进而通过GABAA受体上的NSTs作用位点增强GABA传导功能，改变神经元兴奋性，并抑制HPA轴功能，调节情绪及应激反应[17]，这些都说明了TSPO在药物发挥抗抑郁效果中起着关键的作用，与本研究的结果相符。

芍药内酯苷的抗抑郁作用在动物实验中能被TSPO拮抗剂PK11195阻断，说明芍药内酯苷的抗抑郁药效与TSPO有相关性。在机制研究中发现，芍药内酯苷还能增加小鼠海马TSPO表达，并提高其下游NSTs含量，这些作用也能被PK11195阻断，进一步说明了芍药内酯苷的抗抑郁作用与TSPO的关系。

综上所述，给予芍药内酯苷后，可以改善慢性应激模型小鼠的抑郁样及焦虑样行为，其作用机制可能与TSPO有关。但目前对芍药内酯苷抗抑郁作用的其他靶点及完整途径还不够明确，其具体的物质基础和作用机制还有待进一步研究。