H-ras、ERK1和Ki-67在鼠口腔癌变黏膜中的表达

谢天会，孟宪瑞，岳阳丽

(1.郑州市口腔医院 口腔科，河南 郑州 450052；2.濮阳市第三人民医院 口腔科，河南 濮阳 457000；3.郑州大学口腔医学院 口腔病理教研室，河南 郑州 450052)

口腔癌是常见的口腔颌面部恶性肿瘤之一，发生于口腔黏膜上皮组织，其发生发展是一个漫长的过程，多种基因和信号分子参与其中，比较重要的有Ras/Raf/MEK/ERK信号传导通路，该通路是细胞发生增殖和癌变的重要路径。在这一信号通路中H-ras和ERK1是重要的2个蛋白分子，他们和细胞癌变的机制密切相关，目前关于H-ras和ERK1在口腔腭黏膜癌变中的研究罕见。Ki-67是一种细胞增殖相关的核抗原，是检测细胞增殖活性的常用指标，目前在恶性肿瘤的研究中有较多应用，用于检测肿瘤细胞的增殖程度，对于评估预后有一定的参考价值[1]。为了解H-ras、ERK1和Ki-67在口腔黏膜癌变中的表达，本研究采用免疫组化方法观察了大鼠腭部正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中H-ras、ERK1和Ki-67蛋白的表达，以探讨H-ras、ERK1和Ki-67与口腔癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与标本兔多抗ERK1抗体(浓缩型工作浓度1∶200)；免疫组织化学检测试剂盒兔/鼠SP Kit；DAB试剂盒及相关的配套试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。H-ras兔多抗抗体(浓缩型工作浓度1∶100)购自武汉博士德生物工程有限公司。 Ki-67兔多抗抗体(浓缩型工作浓度1∶100)购自武汉博士德生物工程有限公司。研究所用标本均为郑州大学口腔医学院口腔病理科实验动物大鼠口腔腭部癌变标本，经体积分数为4%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，染色，4 μm连续切片。切片经组织病理学观察分析，有鼠正常腭部黏膜15例，上皮异常增生26例，原位癌和微浸润癌28例。以上标本均经过2位高年资的病理科医生进行双盲法阅片，并最终取得一致结果。

1.2 方法

1.2.1标本处理 鼠腭部正常黏膜、上皮异常增生黏膜及口腔癌病变组织经4%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，用于免疫组化研究。

1.2.2免疫组化 按照免疫组化SP试剂盒说明书的步骤操作，每次实验均以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3免疫组化结果判定 显微镜观察，借助图像分析软件，每张切片随机选取5个高倍视野，计算阳性细胞在视野中总细胞数的占比，根据比例不同分为4级：Ⅰ级，阳性细胞数<10%，记为(-)；Ⅱ级，阳性细胞数11%～25%，记为(+)；Ⅲ级，阳性细胞数26%～50%记为(++)；Ⅳ级，阳性细胞数>50%，记为(+++)。

1.3 统计学方法实验数据均经SPSS 11.0统计软件分析处理，计数资料以频数(n)和百分比(%)表示，采用χ2检验比较，运用Spearman相关性分析检验H-ras、ERK1和Ki-67表达的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果ERK1、H-ras和Ki-67阳性染色表现为细胞核和/或细胞浆呈现棕黄色颗粒，ERK1阳性染色位于细胞浆和/或细胞核内，以细胞浆着色为主；H-ras阳性染色位于细胞质内；Ki-67阳性染色位于细胞核内。ERK1在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达见图1～3；H-ras在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达见图 4～6；Ki-67在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达见图7～9。

图1 ERK1在鼠正常口腔黏膜的表达呈阴性(100×)

图2 ERK1在鼠增生口腔黏膜的表达呈阳性(×100)

图3 ERK1在鼠口腔黏膜鳞癌中的表达呈阳性(×100)

图4 H-ras在鼠正常口腔黏膜的表达呈阴性(×100)

图5 H-ras在鼠增生口腔黏膜的表达呈阳性(×100)

图6 H-ras在鼠口腔黏膜鳞癌中的表达呈阳性(×100)

图7 Ki-67在鼠正常口腔黏膜的表达呈阴性(×100)

图8 Ki-67在鼠增生口腔黏膜中的表达呈阳性(×100)

图9 Ki-67在鼠口腔黏膜鳞癌中的表达呈阳性(×100)

2.2 ERK1表达结果ERK1在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 ERK1在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达(n,%)

2.3 H-ras表达结果H-ras在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 H-ras在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达(n,%)

2.4 Ki-67表达结果Ki-67在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 Ki-67在鼠口腔正常黏膜、异常增生黏膜和癌变黏膜中的表达(n,%)

2.5 相关性分析ERK1与H-ras表达呈正相关，见表4。ERK1与Ki-67呈正相关，见表5。H-ras与Ki-67呈正相关，见表6。

表4 ERK1与H-ras的相关性分析

表5 ERK1与Ki-67的相关性分析

表6 H-ras与Ki-67的相关性分析

3 讨论

口腔癌是人体最常见的恶性肿瘤之一，发生于口腔黏膜上皮，从正常的口腔黏膜上皮发展到癌一般需要数年时间。在形态学上，正常的口腔黏膜发生变化，黏膜上皮单纯性增生，进而上皮异常增生，包括轻度、中度和重度异常增生，再进一步发展成原位癌，癌细胞突破黏膜基底层，成为微浸润癌，癌细胞可以进一步扩散到黏膜下层，累及肌肉和腺体。癌细胞一般通过淋巴系统扩散，通过淋巴结转移到肺等器官，危及生命。口腔癌的治疗手段主要是手术切除，早期发现、早期治疗尤为重要[2]。本实验通过前期建立的鼠口腔癌动物模型，获得了鼠口腔黏膜不同发展阶段的组织切片，为探讨了口腔癌发生发展的分子机制。

H-ras基因是一种原癌基因，在肿瘤的发生发展中起重要作用，其与某些肿瘤发生有显著的相关性，例如在胃癌的研究中发现，正常胃黏膜H-ras表达阴性，良性溃疡H-ras阳性表达不明显，而在癌前病变和胃癌中显著表达，表明H-ras在胃癌的启动阶段发挥了重要作用[3]。H-ras在口腔鳞癌的研究较少涉及，有研究者对舌鳞癌中H-ras的表达进行了研究[4]，结果显示，舌鳞癌组织中H-ras阳性表达率显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义。本研究基于鼠口腔癌动物模型和免疫组织化学染色技术，观察H-ras在各阶段病变黏膜中的表达，结果显示，鼠正常黏膜中表达较少，在异常增生黏膜和口腔癌黏膜中表达率依次增高，阳性率分别为50.00%和85.70%，组间差异有统计学意义，推断H-ras基因可能参与了鳞状细胞癌的发生发展。H-ras基因作为细胞内信号分子，其作用机制不太明确，推测其在细胞增殖和分化中起着重要的调控作用[5]。

ERK1是细胞外信号调节激酶，是丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路中的重要分子。检索文献显示，ERK1在恶性肿瘤如肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等有过度表达。赵雅娟等[6]研究结果显示正常肝组织中ERK1呈阴性或表达较弱，肝癌组织中ERK1呈强阳性表达，经统计学分析，二者差异有统计学意义。正常肝组织、癌旁肝组织、肝癌组织中ERK1的表达差异显著并呈逐级递增的趋势，提示ERK1的过量表达可能促使肝细胞的恶性转化。ERK1在口腔癌方面的研究罕见报道，本研究用免疫组织化学染色技术发现ERK1在鼠口腔正常黏膜中表达率仅为13.3%，在异常增生黏膜和癌变黏膜中表达率分别为57.7%和89.3%，3组间总体差异和各组间差异有统计学意义。ERK1在正常黏膜、异常增生黏膜和口腔癌组织中表达水平依次增高，提示其在口腔黏膜癌变及发展过程中发挥重要作用，对口腔癌的早期诊断具有一定的参考意义。

Ki-67是细胞周期相关的增殖细胞核抗原，Ki-67表达水平可以作为评价细胞增殖活性的重要指标，广泛应用于基础研究和临床实践中。Ki-67在众多恶性肿瘤中有所研究，郑皓等[7]的结果发现，Ki-67在食管正常黏膜不表达或有少量表达，而在食管鳞癌组织中，Ki-67阳性表达率达60%以上 ，提示食管癌组织中，细胞增殖活性较高。有研究者对正常胃黏膜及胃癌组织进行了Ki-67的表达研究，结果显示正常胃黏膜无Ki-67抗原表达，在胃黏膜上皮异常增生中呈阳性表达，而在胃癌组织中有强阳性表达，说明肿瘤细胞有异常的增殖活性[8]。本研究用免疫组织化学染色技术对鼠的动物模型标本进行了细胞增殖方面的研究，染色结果显示Ki-67在鼠口腔正常上皮黏膜表达率为6.7%，在异常增生黏膜和口腔癌黏膜中表达率依次增高，分别为57.70%和92.90%，3组间总体差异和各组间差异有统计学意义。Ki-67在鼠正常黏膜、异常增生黏膜和口腔癌中表达水平依次增高，进一步说明在鼠口腔黏膜上皮的癌变过程中细胞增殖活性逐渐增高，Ki-67的表达情况对口腔癌的早期诊断具有一定意义。

综上所述，Ki-67、ERK1和H-ras在鼠口腔正常黏膜、增生黏膜和癌变黏膜之间表达水平存在差异，在鼠口腔黏膜癌变过程中发挥重要作用，研究这3个蛋白在口腔黏膜癌变过程中的表达，可能有助于解释黏膜癌变的机制，也可以作为口腔癌发生的早期指标，为口腔癌的早期诊断、早期发现提供分子靶点。