Galectin-3 诱导CCL3表达促进椎间盘软骨终板退变的分子机制研究

刘岩路，胡炜，汪梦琪，黄异飞

（新疆医科大学第四附属医院脊柱二科，新疆 乌鲁木齐 830000）

0 引言

腰痛（LBP）是一种与脊柱的肌肉及骨骼相关的最常见的疾病。它最主要的表现为肋缘以及臀下皱襞之间产生的疼痛，包括僵硬与肌肉紧张，甚至会影响膝关节以下，小腿的周围的神经根甚至小腿疼痛[1]。全世界的LBP发生比例约为85%，在任意给定时间，任意年龄段的LBP的发生率约为18%[1]。除此之外，每个人在一生当中，经历LBP的可能性约为80%[2]。目前，腰背痛（LBP）已经成为一种全球性质的与医疗保健相关的问题，比任何其他疾病都更能引起全球性的残疾[3]。严重的影响了患者的心理健康、生活质量以及经济负担。伴随着全球人口的老龄化，与LBP疾病相关的多种负担会以指数级增加[4-5]。在临床诊疗中，LBP可能引起多种疾病的相关症状，而腰椎间盘的退变是导致LBP产生的最主要因素[6]。单从形态学上来说，腰椎间盘内并无血管走行，而椎间盘内的营养的供应及代谢物质的运输最主要是依靠软骨终板来完成的[7]。只要腰椎间盘出现了退变的现象，就会进一步导致椎间盘软骨终板出现撕裂、硬化，从而进一步导致椎管狭窄、椎间隙变窄等一系列临床问题，最后导致腰椎间盘的形状、稳定性及功能的缺失，使得LBP发生与恶化[8-10]。

Galectin-3是一种质量大小为29至35kDa之间的蛋白质，属于β-半乳糖苷结合类动物凝集素家族，在多种组织中都有表达。近年发现[11]，半乳糖凝集素 Galectin-3可被作为细胞标记物和促生存因子，细胞及软骨细胞之间相互作用的调节类因子，是一种靶蛋白与MMPs活性的调节类因子。预测 Galectin-3 可通过调节细胞外基质降解及炎性细胞浸润从而在脊柱退变中发挥作用。为此项目组在前期工作基础上，拟进一步以软骨终板退变为切入点，系统研究和确立半乳糖凝集素 Galectin-3 通过激活 MMPs、Aggrecan等蛋白降解酶正调节CCL3 在软骨终板中的表达,进而促进了巨噬细胞迁移并进一步阐明调节 CCL3 表达的分子作用机制，从全新的方面来阐述了椎间盘软骨终板退变可能的作用及相关机制。借此为建立通过干预 Galectin-3延缓脊柱退变的治疗策略提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞：大鼠椎间盘软骨终板细胞和大鼠椎间盘软骨终板细胞培养基，Procell，中国；MTT试剂盒，BIOFROX，中国；Fetal Bovine Serum，Penicillin-Streptomycin，Trypsin-EDTA (0.25%)， phenol red，GIBCO，美国；TIANScript RT Kit，SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen），天根，中国；BCA蛋白浓度测定试剂盒，Solarbio，中国；CCL3 Rabbit pAb(A7568)， Abclonal，中国；Anti-MMP3抗体[EP1186Y]， Abcam， 美国；Aggrecan Polyclonal Antibody，Proteintech，中国。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞复苏与传代

将大鼠椎间盘软骨终板细胞从低温液氮里取出，然后快速放入37℃的水浴锅当中，然后轻轻摇动冻存管，使得冻存液溶解；待溶解以后将细胞转移到另含有5mL培养基的离心管之中，离心法收集细胞，使用含有10%胎牛血清的完全培养基来悬浮细胞，然后接种到培养皿中，并且轻轻吹打来混匀，在37℃ 5%CO2的饱和湿度条件下来培养。间隔每2天都更换培养液一次。待细胞融合到80%左右，用0.25%胰蛋白酶-EDTA来收集细胞，按照1:3来传代，最后取 P2 代的细胞来进行实验。

1.2.2 细胞存活率分析

取正处于对数生长期，且生长状态相对良好的大鼠椎间盘软骨终板细胞，以5×103个/孔，接入96孔板，同时设空白组对照，使用37℃培养条件过夜（并且在所有细胞孔周围孔内加入100μL无菌PBS），然后按以下分组条件对细胞来进行处理：对照组和Galectin-3抑制剂组（GB1107 25uM），处理的时间分别为12h、24h、48h。在指定时间之内，每个孔都加入10μLMTT，37℃温度条件下培养4h；而后吸出培养基组织，加入150μLDMSO震荡10min，使用酶标仪测定各个孔的吸光值OD 568。 所有的实验重复三次。

1.2.3 RT-qPCR

通过DNAMAN软件设计MMP3、Aggrecan、CCL3荧光实时定量PCR引物，由上海生工有限公司生产合成。分别加入2μL5×PrimeScript Buffer，0.5μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligo（dT）15 (15μM)，0.5 μLRandom 6 mers (100μM)，Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O达到10μL，混匀后短暂离心，放于PCR仪上37℃温度条件下温浴15min，85 ℃温度条件下加热5s，稀释至35μL，即得到反转录的cDNA。qPCR反应：Forward primer 10 µM 0.8μL，0.8 μLReverse primer 10µM，2XSYBR Select Master Mix (2×) 10μL，RNase-free water 6.4 μL，cDNA template 2μL，配制成20μL体系且混合均匀，放在仪器上持续保持95℃，1 min，95℃，10s，60℃ 34s，做40个循环，94℃ 1min 30s，60℃ 1min，60℃→94℃，1.1℃/s升温，从而最终获得qPCR反应的结果，使用2-ΔΔCt方法用于结果量化计算。

1.2.4 Western-Blot

将PBS洗净细胞中加入120μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，在4℃温度条件下12000rpm转速离心5min后，取适量稀释的上清溶液，使用 BCA测定法来测定蛋白的浓度，在调整蛋白质浓度之后，使用免疫印迹法( Western blot) 检测细胞内MMP3、Aggrecan、CCL3的表达，步骤大致如下：经过灌胶、加样、电泳、转膜之后，将膜装入含量5% 的牛血清白蛋白(BSA)封闭液当中，放置室温摇床中1h，并加入5mL（1:1000）一抗稀释液在4℃冰箱中过夜。然后加入10mL(1:50000 )二抗稀释液并置于摇床上2h后，显色，在暗室里压片至曝光显影，结果使用 Quantity-one图像软件分析后并进行光密度值扫描计算，分别来计算目的蛋白条带及GAPDH强度的比值关系( % ) 。

1.3 统计学方法

2 实验结果

2.1 MTT的检测结果

使用MTT检测方法，Galectin-3抑制剂组（GB1107 25uM）在不同的时间段内进行的细胞活性检测，实验结果最终如图1所示。在Galectin-3抑制剂GB1107干预条件下，大鼠椎间盘软骨终板细胞在12h的时间开始，细胞活性开始逐渐降低，随着时间的不断推移，细胞的活性不断的在下降。在24h抑制剂作用下，抑制细胞的活性率最终可达69%，在48h时，细胞活性持续降低，最终达到54%。3个时间段内细胞活性都与对照组差异有统计学意义，P<0.05。因此，这些数据可以证明细胞的增殖的能力与Galectin-3抑制剂作用时间成负相关。

图1 各时间点和对大鼠软骨终板细胞活性的影响

2.2 两组中MMP3、Aggrecan、CCL3的基因表达情况

采用实时荧光定量PCR法来定量检测两组大鼠软骨终板细胞当中MMP3、Aggrecan、CCL3的mRNA表达情况，具体见图2。在加入Galectin-3抑制剂GB1107 25uM组的大鼠软骨终板细胞中MMP3、Aggrecan、CCL3 mRNA表达量较于对照组显著降低，P<0.05。

图2 两组中MMP3、Aggrecan、CCL3的基因表达情况

2.3 两组中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表达差异

采用Western blot法检测两组大鼠软骨终板细胞中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表达差异性，具体见图3。在加入Galectin-3抑制剂GB1107 25uM组的大鼠软骨终板细胞中MMP3、Aggrecan、CCL3 蛋白表达量较于对照组显著降低，P<0.05。

图3 两组中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表达差异

3 讨论

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）是一类椎间盘自然产生退化的生理病理的自然过程。自上世纪初，通过对椎间盘退变的不断研究，发现其致病主要因素包括：应力的损伤、炎症反应、衰老、感染、营养过程的障碍、遗传以及肿瘤等，这些因素会导致IVDD的发生和恶化[12-13]。软骨终板成分是椎间盘的非常重要组成部分，它在维持脊柱椎体的正常形态，保护椎体承受各种压力，并且吸收静态的压力等方面起到积极的作用，同时终板组织又是椎体当中渗透转运能力的最主要的承担者，是椎体骨组织中主要营养的供应通路[14]。终板的退变老化与IVDD的产生有着十分密切的联系。但至今其中的确切机制仍不清楚。

本次研究首次通过研究Galectin-3与MMP3、Aggrecan、CCL3在椎间盘软骨终板内的相互关系，阐明软骨终板退变的可能作用机制。椎体终板组织主要是由软骨细胞和细胞外的基质组织（extracellular matrix，ECM）组成。基质金属蛋白酶家族（MMPs）是一种能够降解 ECM 的降解酶。已有研究表明[15]，当软骨终板受损时，会使基质金属蛋白酶表达增加，抑制物表达降低，加剧ECM的降解，诱导软骨终板的破坏，导致软骨终板退变。MMP3在软骨破损中起到级联放大反应，降解蛋白多糖，在软骨终板中起到至关重要的作用[16]。李龙滕[17]通过研究发现，患者关节软骨体外培养液当中MMP3的表达量显著增高，表明MMP3可能是导致关节软骨细胞退化的最重要细胞因子之一。朱新辉等[18]也通过研究发现，MMP3水平与膝关节骨关节炎病变严重的程度(Kellgren-Lawrence分级)呈现正相关。

聚集蛋白聚糖（Aggrecan）是椎间盘里蛋白聚糖当中最主要的一种，在椎间盘内起到渗透和抗机械压载荷的作用[19]。Aggrecan对软骨基质的降解起到非常重要的作用[19]。当软骨终板受损，会导致蛋白聚糖的丢失而脱水，最终导致软骨细胞基质的降解，然后诱导软骨终板的退变，同时随着重复的损伤而进一步增强[20-21]。温俊等[22]人通过对大鼠的Aggrecan基因过表达实验发现，过表达Aggrecan可以降低基质的降解，缓解关节软骨的退变。

CCL3又被称做巨噬细胞炎性蛋白，其具有募集巨噬细胞的重要功能。而且在炎症反应以及免疫应答中都发挥着重要的作用[23]。CCL3的表达会促进巨噬细胞发生迁移。有研究证明[24]，CCL3的表达的水平与椎间盘退变的程度呈正相关性，表明 CCL3 可能具有促进椎间盘退变的作用。

本次研究发现，在Galectin-3抑制剂组当中，细胞活性显著降低，MMP3、Aggrecan、CCL3的基因和蛋白表达量明显减少，表明Galectin-3与细胞活性、MMP3、Aggrecan、CCL3之间成正相关。我们推测抑制Galectin-3的表达，可以降低MMP3、Aggrecan对细胞外基质的降解，减少CCL3对巨噬细胞迁移的作用，进而抑制软骨终板的退变。在全新方面阐述了软骨终板退变可能出现的作用机制，这为椎间盘退变的诊断提供了更多更新的思路与方向，在临床上可用于其表达水平来判断治疗，为预防和治疗椎间盘软骨终板退变及相关的疾病研究提供新的理论与实验基础。